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HE染色全名為蘇木精(hematoxylin)和伊紅(eosin)染色方法，是最基本的也是最重要的病理學(xué)染色技術(shù)。

HE切片是病理醫(yī)生得以做出正確診斷的關(guān)鍵。HE染色是目前國(guó)內(nèi)外病理診斷上廣泛采用的 常規(guī)染色方法。切片質(zhì)量的好壞，可直接影響疾病診斷的及時(shí)與準(zhǔn)確性。因此，能制作出一張高質(zhì)量的HE染色切片，是必須掌握的技術(shù)之一。

01染色原理

1.細(xì)胞核染色原理：

蘇木精為堿性天然染料，可使細(xì)胞核著色。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的成分主要是DNA，在DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋的外側(cè)帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性燃料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。

2.細(xì)胞漿染色原理：

細(xì)胞漿內(nèi)主要成分是蛋白質(zhì)，為兩性化合物、細(xì)胞漿的染色與pH值有密切關(guān)系，當(dāng)pH調(diào)到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)4.7-5.0時(shí)，胞漿對(duì)外不顯電性，此時(shí)酸或堿性染料不易染色。當(dāng)pH調(diào)到6.7-6.8時(shí)，大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pH值，表現(xiàn)酸性電離，而帶負(fù)電荷的陰離子，可被帶正電荷的染料染色，現(xiàn)時(shí)胞核也被染色，核和胞漿難以區(qū)分。因此必須把pH調(diào)至胞漿等電點(diǎn)以下，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷（陽離子），就可被帶負(fù)電荷（陰離子）的染料染色。伊紅Y是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷（陽離子）結(jié)合而使細(xì)胞漿染色，細(xì)胞漿、紅細(xì)胞、肌肉、結(jié)締組織，嗜伊紅顆料等被感染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明的對(duì)比。

3.分化作用：

染色后，用某些特定的溶液將組織過多結(jié)合的染色劑脫去，這個(gè)過程稱為分化作用，所用的溶液稱為分化液。在HE染色中用0.5%鹽酸乙醇作為分化液，因酸能破壞蘇木精的醌型結(jié)構(gòu)，使組織與色素分離而褪色。經(jīng)蘇木精染色后，必須用0.5%鹽酸乙醇分化，使細(xì)胞核過多結(jié)合的蘇木精染料和細(xì)胞漿吸附的蘇木精染料脫去，再進(jìn)行伊紅染色，才能保證細(xì)胞核與細(xì)胞漿染色的分明。因此，在HE染色中分化是極為關(guān)鍵的一步。

4.返藍(lán)作用：

分化之后，蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，呈紅色，在堿性條件下處于藍(lán)色離子狀態(tài)，呈藍(lán)色。組織切片經(jīng)0.5%鹽酸乙醇分化后呈紅色或粉紅色，故分化之后，立即用水除去組織切片上的酸而終止分化，再用弱堿性水（0.2%氨水）使蘇木精染上的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，這個(gè)過程稱為返藍(lán)作用或藍(lán)化作用。另外用自來水浸洗也可使細(xì)胞核返藍(lán)，但所需時(shí)間較長(zhǎng)。

02染色步驟

固定液：常用95%乙醇和冰丙酮

蘇木精染液：稱取蘇木精粉0.5g，銨礬24g溶解于70ml蒸餾水中，然后取NaIO 31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均勻，濾紙過濾，備用。

伊紅染液：稱取0.5g水溶性伊紅染液，溶于100ml蒸餾水中。

稀鹽酸乙醇溶液：用75%乙醇配制1%鹽酸。

系列濃度的乙醇、二甲苯、中性樹膠。

1.樣品制備：

對(duì)于貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度約1×105/ml，滴加于蓋玻片上(置于6孔板中)，培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，取出細(xì)胞爬片，用PBS 洗滌3次。

2.樣品固定：

95%乙醇固定20min，PBS洗滌2次，每次1min。

3.染核：

蘇木素染液染色2-3min，自來水洗滌。

4.分色：

鏡下觀察，若細(xì)胞核染色過深，用1%鹽酸酒精溶液分色數(shù)秒，自來水洗滌。

5.染胞質(zhì)：

浸入伊紅染液染色1min，自來水洗滌。

6.吹干或自然晾干細(xì)胞 爬片后，中性樹膠封片。

注：若細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，則染色時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，蘇木素染色12-15min，伊紅5min即可。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)，肌纖維，膠原纖維和紅細(xì)胞呈不同程度的紅色。鈣鹽和細(xì)菌可呈藍(lán)色或紫藍(lán)色。

03注意事項(xiàng)

1.染色時(shí)調(diào)節(jié)pH值很重要。如果組織塊在福爾馬林中固定時(shí)間長(zhǎng)，組織酸化而影響細(xì)胞核著色。因此，要在自來水中沖洗時(shí)間長(zhǎng)一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30min，這樣可以使細(xì)胞核著色較深。染伊紅時(shí)胞漿著色不佳，可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。 

2.切片染蘇木精后，分色這一步是關(guān)鍵，應(yīng)在顯微鏡下控制進(jìn)行，一般以細(xì)胞核染色清楚（晰）而細(xì)胞質(zhì)基本無色為佳。如果過分延長(zhǎng)分色時(shí)間將導(dǎo)致染色太淺，應(yīng)重新染色后再行分色。 

3.切片經(jīng)酒精脫水后，入二甲苯時(shí)可出現(xiàn)白色不透明狀態(tài)，此為脫水不徹底，應(yīng)將切片退回?zé)o水酒精，更換酒精、二甲苯，以求徹底脫水與透明。 

4.在染色過程中不要讓切片干燥，以免切片收縮、變形，影響神經(jīng)元形態(tài)。

5.切片從二甲苯取出或進(jìn)入二甲苯前，切片周邊均應(yīng)擦干凈或吸干多余水分。 

6.最后封固時(shí)，要用中性樹脂，防止日后褪色，蓋片要選大于組織塊的面積，如漏出一部分不久將會(huì)褪色，所用樹脂濃度要適當(dāng)，樹脂封固時(shí)不能有氣泡。 

7.避免切片污染。出現(xiàn)切片污染，污染物遮蓋該部位的細(xì)胞或組織難以觀察期形態(tài)改變。應(yīng)定期過濾各種染液和試劑以避免其中的沉淀物所引起的污染。

8.冬季室溫低時(shí)（14℃以下），二甲苯應(yīng)在水浴缸中適當(dāng)加溫到30℃后再脫蠟，以避免因脫蠟不完全引起的染色不均勻呈霧化狀態(tài)。

04常見問題

優(yōu)質(zhì)的HE染色切片應(yīng)該具備切片完整、無皺褶、細(xì)胞核著色清晰呈藍(lán)色、細(xì)胞質(zhì)呈鮮紅色、核仁核膜核內(nèi)染色質(zhì)顆粒清晰，核質(zhì)藍(lán)紅分明、對(duì)比清晰、透明度好等屬性；劣質(zhì)的HE染色切片會(huì)出現(xiàn)切片不完整，染色灰暗，紅藍(lán)對(duì)比不明顯，有甚者染色后的切片鏡下呈云霧狀、組織結(jié)構(gòu)不清楚等狀況，對(duì)于科研黨和病理檢驗(yàn)工作者來說，想要一張好的組織HE染色圖，看似簡(jiǎn)單但也不簡(jiǎn)單。目前，我們收集了一些導(dǎo)致組織切片染色不佳的原因及解決辦法，希望對(duì)大家的科研工作有一定的幫助。

1.切片污染：包括染液的污染和組織污染

所謂染色的污染，是由于蘇木精染液的氧化膜或伊紅染液的絮狀沉淀和其他試劑中的沉淀物所致。污染物遮蓋該部位的細(xì)胞或組織而難以觀察期形態(tài)改變。這種污染可通過定期的過濾各種染液和試劑而避免。而所謂的組織污染是由于切片和貼片過程中，被其他病例的組織和細(xì)胞污染。如果是不同類型的組織，容易在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)；如果是相同類型而不同病變的組織污染，不容易在鏡下發(fā)現(xiàn)，可導(dǎo)致誤診。因此在攤片時(shí)要非常小心，恒溫貼片盆的水要常常更換或于每例貼片后用紙?jiān)谒婕皶r(shí)把殘余的蠟片拖走，以保證不污染。還有，取材時(shí)也可能造成組織污染，在甲例取材后，如不及時(shí)把取材臺(tái)和刀剪沖洗干凈，若留下殘余組織，在乙例取材時(shí)把甲例的殘余組織誤作為乙例取材，同時(shí)放進(jìn)脫水盒內(nèi)，這樣同一切片內(nèi)，包括甲乙兩例組織，這種組織污染也可產(chǎn)生嚴(yán)重后果。  

2.細(xì)胞核染色蒼白、暗淡，蘇木素染色過淺

造成此類問題的原因可能有3個(gè)，切片在蘇木精染色液停留時(shí)間過短，蘇木素染色液過度氧化，失去染色能力，鹽酸酒精的分化步驟處理時(shí)間過長(zhǎng)。此類問題可以更換新的蘇木素及調(diào)節(jié)染色和分化時(shí)間來解決。  

3.染色不均勻不透亮呈霧化狀態(tài)

即部分組織和細(xì)胞染色尚可，部分組織模糊不清楚，這種染色組織無法診斷。其原因是由于染色時(shí)二甲苯脫蠟不徹底，導(dǎo)致組織處理不當(dāng)。常見于冬季室溫低時(shí)，二甲苯的脫蠟?zāi)芰档停蚴褂枚啻蚊撓灥亩妆剿?，克服辦法是在冬季室溫低時(shí)(14℃以下)，把二甲苯缸在水浴缸中適當(dāng)加溫到30℃再脫蠟，或更換新的二甲苯。  

4.切片在脫蠟后出現(xiàn)大片白色的斑點(diǎn)

由于烤片溫度太低，玻片在脫蠟前沒有充分烤干凈組織中的石蠟；切片在二甲苯停留時(shí)間不足，或二甲苯使用過久，造成脫蠟不盡。若烤片時(shí)間過短，則可能導(dǎo)致切片脫落的現(xiàn)象。出現(xiàn)白色斑點(diǎn)是由于切片在二甲苯停留時(shí)間不足或脫蠟用的二甲苯使用過久造成，此時(shí)切片可以退回到二甲苯停留時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)些，或更換新的二甲苯，然后進(jìn)行重新染色程序的染色。

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主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

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