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【實(shí)驗(yàn)原理】

微生物多樣性測(cè)序是對(duì)環(huán)境樣品中細(xì)菌（16S rDNA）、真菌（18S/ITS）、功能基因等基因的DNA進(jìn)行特定長(zhǎng)度的PCR擴(kuò)增并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的分析，可實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境樣品中的優(yōu)勢(shì)物種、稀有物種和一些未知物種進(jìn)行檢測(cè)，精準(zhǔn)解析微生物在種屬水平上的組成和豐度情況，是當(dāng)前研究環(huán)境微生物多樣性及群落組成差異的重要技術(shù)手段。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

1.文件準(zhǔn)備:確保所有輸入文件已就緒。

2.數(shù)據(jù)合并:合并樣本數(shù)據(jù)以進(jìn)行質(zhì)控。

3.質(zhì)控處理:使用 cutadapt 進(jìn)行序列修剪。

4.OTU表生成:通過去噪生成操作分類單元(OTU)表。

5.系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建:為OTU表中的代表性序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

6.物種注釋:使用分類器對(duì)OTU表中的序列進(jìn)行物種注釋。

7.多樣性分析:進(jìn)行Alpha和Beta多樣性分析。

8.差異分析:使用ANCOM、PicRust和LEfSE進(jìn)行組間差異分析。

【常見問題與注意事項(xiàng)】

01. 什么是微生物種群多樣性測(cè)序？

微生物種群鑒定為通過高通量測(cè)序?qū)?xì)菌的 16S rRNA 基因和真菌的 18S rRNA 基因、 ITS 序列進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)而鑒定微生物種群。16S rRNA 基因（18S rRNA 基因）指的是細(xì)菌 （真菌）基因組中編碼核糖體16S rRNA (18S rRNA）的對(duì)應(yīng)的 DNA 序列，也就是 16S rRNA (18S rRNA）的編碼基因，其包括 9 個(gè)高變區(qū)域（V1-V9）和 10 個(gè)保守區(qū)域。ITS（Internal Transcribed Spacer），即核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，ITS 分為兩個(gè)區(qū)域：ITS1/ITS2，ITS1 位于真核生物核糖體 rRNA 基因序列的 18S 和 5.8S 之間，ITS2 位于真核生物核糖體 rRNA 基因序列的 5.8S 和 28S 之間。通過對(duì)特定高變區(qū)測(cè)序獲取微生物的物種及豐度信息。

02. 某個(gè)物種在提供的分析結(jié)果中未檢測(cè)到，是否能說明樣品中不存在該物種？

理論上，經(jīng)分析后樣本中沒有這類物種的信息，意味著樣品中是沒有這類物種。實(shí)際上存在兩種情況會(huì)影響這一判斷，一是所用的PCR引物有偏好，即樣品中存在該類物種（一般豐度較低），但是PCR未擴(kuò)增出來，因此后續(xù)測(cè)序檢測(cè)不到；其次是數(shù)據(jù)庫中缺少此類物種的相關(guān)信息，因此即使測(cè)得的序列中含有該物種，但是分析時(shí)比對(duì)不到此物種信息。

03. 關(guān)于微生物多樣性項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，為什么要設(shè)置生物學(xué)重復(fù)？

在多樣性項(xiàng)目的設(shè)計(jì)中，是否設(shè)置生物學(xué)重復(fù)的確是一個(gè)很重要的問題。尤其是關(guān)注差異分析的研究項(xiàng)目，而在差異分析中，基本都會(huì)涉及有參和無參兩種檢驗(yàn)方法，如 t 檢驗(yàn)， 秩和檢驗(yàn)等。無論哪種檢驗(yàn)方法都需要用到諸如方差，均值等計(jì)算，必須要有生物學(xué)重復(fù)才能產(chǎn)生數(shù)值。所以首先生物學(xué)重復(fù)從數(shù)據(jù)分析原理上講是必須的。此外，多樣性研究的環(huán)境樣本等受到的影響因素較為復(fù)雜，單純的一個(gè)樣本代表一個(gè)分組，結(jié)果是不可靠的，生物學(xué)重復(fù)的設(shè)置使研究更有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義。

04. 生物學(xué)重復(fù)，技術(shù)重復(fù)與混樣的差別？

不限于多樣性研究，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，生物學(xué)重復(fù)、技術(shù)重復(fù)和混樣一直都是影響實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵問題之一。這里分別介紹一下這三個(gè)概念及設(shè)置的意義。

生物學(xué)重復(fù)，簡(jiǎn)單說就是一組進(jìn)行相同處理的不同樣本。生物學(xué)重復(fù)的設(shè)置，是用于概 括性結(jié)論的驗(yàn)證，用一類樣本的相似性結(jié)果概括總結(jié)這一類樣本的特征。

技術(shù)重復(fù)，在實(shí)驗(yàn)過程中，技術(shù)性操作也可能引入一些誤差或偏離，為了說明操作的穩(wěn)定性，證明結(jié)果中的變異在合理范圍內(nèi)，則需要進(jìn)行技術(shù)性重復(fù)操作。以測(cè)序?yàn)槔?，同一個(gè)土壤樣本測(cè)三次，這三次結(jié)果之間即形成一組技術(shù)重復(fù)，用以說明建庫測(cè)序?qū)嶒?yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。

混樣，顧名思義，混樣就是將多個(gè)樣本混勻（多為等量混勻），混樣的意義一方面拉平了單個(gè)樣本間的差異，另一方面也使混勻后的樣本更具有代表性，更能代表此一類樣本的特征。

這三種樣本設(shè)計(jì)方式可以在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中聯(lián)合考慮設(shè)計(jì)，也可以單獨(dú)應(yīng)用，視不同的研究目的進(jìn)行選擇。具體問題可咨詢我公司技術(shù)人員。

05. 常見實(shí)驗(yàn)樣本取樣指南？

土壤樣本取樣：選擇具有代表性的土壤，使用無菌工具，采集5-10cm深的一定量的土壤，去除雜質(zhì)，分裝標(biāo)記，每袋樣品約5-10g，密封后立即低溫保存。

糞便樣本取樣：用無菌糞便采集器或其它滅菌器皿收集糞便樣品，分裝標(biāo)記并立即低溫保存（也可先標(biāo)記并低溫保存后分裝）。每個(gè)樣本分裝幾管滅菌離心管，每管0.2g左右。小鼠個(gè)體較小，糞便不足0.2g時(shí)可將生物學(xué)重復(fù)樣本混合。注意糞便樣品不要在空氣中暴露太長(zhǎng)時(shí)間，避免污染和降解。對(duì)于珍貴和較難收集的樣品，建議老師們進(jìn)行備份

【交付標(biāo)準(zhǔn)】

1. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告 

2. 真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 原始圖片

4. 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過周期，不予返還）

康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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