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【實驗原理】

將細胞小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。

【實驗步驟】

1. 實驗材料準(zhǔn)備：

1. 細胞培養(yǎng)相關(guān)：處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好且無污染的細胞系；細胞培養(yǎng)基，如含血清的完全培養(yǎng)基用于常規(guī)細胞培養(yǎng)、無血清培養(yǎng)基用于實驗；胰酶等細胞消化液，用于消化細胞使其從培養(yǎng)容器表面脫離。

2. 試劑：基質(zhì)膠（如 Matrigel），用于模擬細胞外基質(zhì)；4% 多聚甲醛固定液，用于固定細胞；結(jié)晶紫染液等用于染色；無菌 PBS 緩沖液，用于清洗細胞。

3. 耗材與儀器：Transwell 小室（一種具有通透性膜的小裝置，膜上有微孔可供細胞穿過）；細胞培養(yǎng)板；顯微鏡；槍頭、離心管等常規(guī)實驗耗材；鑷子、濕棉簽等操作工具。

2. Transwell 小室準(zhǔn)備：

1. 基底膜水化（無基質(zhì)膠的小室可省略此步驟）12：

1. 將 Transwell 小室放入孔板中，每個小室孔中加入適量的無血清培養(yǎng)液，一般為 50 μl。

2. 將孔板放入 37℃的細胞培養(yǎng)箱中溫育 30 分鐘，使基底膜充分水化，為后續(xù)細胞的遷移和侵襲提供適宜的環(huán)境。

2. 鋪基質(zhì)膠（模擬細胞外基質(zhì)環(huán)境）：

1. 基質(zhì)膠需提前在 4℃冰箱中過夜融化，并始終保持在冰上操作，防止其在室溫下迅速凝固。

2. 用預(yù)冷的槍頭吸取適量的基質(zhì)膠，垂直地加入到 Transwell 小室的上室底部中央，加膠量要適中，避免過多或過少。例如，對于常見的 24 孔 Transwell 小室，加入 60 - 80 μl 的基質(zhì)膠12。

3. 將加好基質(zhì)膠的 Transwell 小室放入 37℃的細胞培養(yǎng)箱中，孵育一段時間，讓基質(zhì)膠充分聚合凝固，通常需要 30 - 60 分鐘，具體時間可根據(jù)基質(zhì)膠的說明書和實際實驗情況確定。

3. 細胞懸液制備2：

1. 提前對細胞進行饑餓處理，將細胞培養(yǎng)在無血清的培養(yǎng)基中 12 - 24 小時，去除細胞周圍的血清影響，使細胞處于相對同步的狀態(tài)，增強實驗的重復(fù)性。

2. 用胰酶消化細胞，當(dāng)在顯微鏡下觀察到細胞變圓、從培養(yǎng)容器表面脫離時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。

3. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，進行離心，一般以 800 - 1000 rpm 的轉(zhuǎn)速離心 3 - 5 分鐘，去除上清液（即舊的培養(yǎng)液）。

4. 用無菌 PBS 緩沖液洗滌細胞 1 - 2 次，再次離心去除 PBS 緩沖液。

5. 用含有 BSA（牛血清白蛋白）的無血清培養(yǎng)基重新懸浮細胞，調(diào)整細胞密度至合適的濃度，一般為 1 - 10×10? 個 /ml，具體密度可根據(jù)細胞類型和實驗需求進行摸索2。

4. 細胞接種2：

1. 取適量的細胞懸液，加入到 Transwell 小室的上室中，注意要緩慢加入，避免產(chǎn)生氣泡。對于 24 孔 Transwell 小室，一般加入 100 - 200 μl 的細胞懸液。

2. 在孔板的下室中加入適量的含有血清（如 10% 胎牛血清）或特定趨化因子的培養(yǎng)基，作為吸引細胞遷移和侵襲的誘導(dǎo)劑。例如，對于 24 孔板的下室，通常加入 600 μl 的培養(yǎng)基。

5. 細胞培養(yǎng)：

1. 將接種好細胞的 Transwell 小室放入細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間根據(jù)細胞的遷移和侵襲能力而定，通常為 12 - 48 小時2。

2. 在培養(yǎng)過程中，定期觀察細胞的狀態(tài)和小室的情況，如是否有氣泡產(chǎn)生等2。

6. 結(jié)果統(tǒng)計2：

1. 直接計數(shù)法：

1. 細胞固定：小心取出 Transwell 小室，吸去上室內(nèi)的培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦拭基質(zhì)膠和上室內(nèi)未穿過膜的細胞。然后，將小室放入含有 4% 多聚甲醛的孔板中進行固定，固定時間為 20 - 30 分鐘。

2. 細胞染色：吸去固定液后，將小室移至預(yù)先加入結(jié)晶紫染液的孔中，讓細胞染色 15 - 30 分鐘。之后，去除未與細胞結(jié)合的結(jié)晶紫，可輕輕用棉簽擦拭小室的上側(cè)。

3. 細胞計數(shù)：用清水沖洗小室，吸干上室內(nèi)的液體。使用鑷子小心地將膜揭下，確保底面朝上并風(fēng)干。將膜轉(zhuǎn)移到載玻片上，用中性樹膠進行封片。在高倍顯微鏡下觀察和拍照，隨機選擇多個視野（如 5 個或更多），計數(shù)呈紫色的陽性細胞，最后統(tǒng)計結(jié)果。

2. 間接計數(shù)法：如 MTT 法、熒光試劑檢測等。以 MTT 法為例，吸去上室內(nèi)的培養(yǎng)基和未穿過膜的細胞，在孔板中加入含 MTT 的完全培養(yǎng)基，孵育后加入 DMSO 溶解甲臜，最后在酶標(biāo)儀上測 OD 值，間接反映細胞的數(shù)量。

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【常見問題與注意事項】

1. 細胞聚集：

1. 原因：細胞懸液制備過程中操作不當(dāng)，如吹打不均勻、離心速度或時間不合適等，導(dǎo)致細胞沒有充分分散，容易聚集在一起；或者細胞本身的特性使得它們之間存在較強的黏附性。在侵襲實驗中，細胞聚集會影響細胞穿過膜的能力，導(dǎo)致實驗結(jié)果不準(zhǔn)確。

2. 解決方法：制備細胞懸液時，要確保吹打均勻，力度適中且避免產(chǎn)生氣泡。可以使用適當(dāng)?shù)募毎Y過濾細胞懸液，去除聚集的細胞團。另外，調(diào)整離心的速度和時間，確保細胞能夠充分沉淀且不被過度損傷。

2. 基質(zhì)膠相關(guān)問題：

1. 膠液凝固異常：

1. 原因：基質(zhì)膠對溫度非常敏感，在室溫下容易迅速凝固。如果在操作過程中，室溫過高或者操作時間過長，基質(zhì)膠可能會在未使用前就過早凝固；相反，如果在鋪膠后溫度過低，膠液可能凝固不完全，影響實驗結(jié)果。

2. 解決方法：整個鋪膠過程應(yīng)在冰上操作，提前將所需的槍頭、離心管等器具在 4℃預(yù)冷。使用前將基質(zhì)膠在 4℃冰箱中過夜融化，確保其處于液態(tài)。在加入基質(zhì)膠到小室時，要迅速且準(zhǔn)確地操作，避免膠液在槍頭或小室中凝固。

2. 膠層不均勻或有氣泡：

1. 原因：在加入基質(zhì)膠時，如果速度不均勻或者角度不合適，容易導(dǎo)致膠層不均勻；操作過程中帶入的空氣或者小室底部不平整，會產(chǎn)生氣泡。膠層不均勻會使細胞穿過膜的難度不一致，而氣泡會阻礙細胞的遷移，影響實驗的準(zhǔn)確性。

2. 解決方法：向小室底部中央垂直加入基質(zhì)膠，保持勻速和穩(wěn)定的操作，使膠液能夠均勻地覆蓋在小室底部。加入膠液后，可以將小室輕輕晃動或放置在水平臺上觀察，如有氣泡，可使用槍頭小心地將其戳破。

3. 細胞穿過膜的數(shù)量異常：

1. 原因：細胞的狀態(tài)不佳，如細胞活力低、處于非對數(shù)生長期、受到污染等，都會影響細胞的侵襲能力，導(dǎo)致穿過膜的細胞數(shù)量減少；實驗中使用的血清濃度、趨化因子等誘導(dǎo)條件不合適，也可能無法有效地吸引細胞穿過膜；另外，小室的孔徑選擇不當(dāng)，對于體積較大的細胞，如果小室孔徑過小，會限制細胞的通過，而孔徑過大則可能導(dǎo)致非侵襲性的細胞也能輕易穿過，影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2. 解決方法：確保使用的細胞處于對數(shù)生長期且活力良好，在實驗前進行細胞活力檢測，細胞活力需大于 95%2。根據(jù)實驗需求和細胞類型，優(yōu)化血清濃度、趨化因子等誘導(dǎo)條件。選擇合適孔徑的小室，一般常用的為 8.0 - μm 孔徑。

4. 染色和計數(shù)問題：

1. 染色不充分或過度染色：

1. 原因：染色液的濃度、染色時間等因素都會影響染色效果。如果染色液濃度過低或染色時間過短，細胞可能染色不充分，導(dǎo)致在顯微鏡下觀察時細胞不清晰，難以準(zhǔn)確計數(shù)；而染色液濃度過高或染色時間過長，會使細胞過度染色，背景顏色深，也會影響細胞的觀察和計數(shù)2。

2. 解決方法：根據(jù)使用的染色液類型，按照說明書或經(jīng)驗確定合適的染色液濃度和染色時間。在染色過程中，可以定期在顯微鏡下觀察染色效果，以便及時調(diào)整染色條件。

2. 計數(shù)不準(zhǔn)確：

1. 原因：在計數(shù)時，如果視野選擇不隨機或者視野數(shù)量過少，會導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果不具有代表性；細胞在膜上的分布不均勻，或者存在細胞重疊的情況，也會影響計數(shù)的準(zhǔn)確性；此外，如果在擦去上室細胞時操作不當(dāng)，可能會將下室的細胞也擦掉，導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果偏低。

2. 解決方法：在計數(shù)時，應(yīng)隨機選擇多個視野，包括上、下、中央、左、右等不同位置的視野，以提高計數(shù)的準(zhǔn)確性和代表性。對于細胞分布不均勻的情況，可以在計數(shù)前輕輕晃動小室，使細胞分布相對均勻。擦去上室細胞時，要使用濕潤的棉簽輕輕擦拭，避免用力過大擦掉下室的細胞。

侵襲實驗注意事項：

1. 實驗材料的準(zhǔn)備：

1. 細胞培養(yǎng)：確保細胞來源可靠，無污染。在實驗前，將細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以保證細胞具有良好的活力和侵襲能力2。

2. 試劑和耗材：基質(zhì)膠需保存在 -20℃，使用前在 4℃過夜融化2。其他試劑如無血清培養(yǎng)基、固定液、染色液等，要確保其質(zhì)量和有效期。Transwell 小室等耗材要選擇質(zhì)量可靠、孔徑合適的產(chǎn)品。

2. 實驗操作過程：

1. 無菌操作：整個實驗過程應(yīng)在無菌條件下進行，包括細胞的培養(yǎng)、試劑的配制和添加、小室的操作等，以避免細胞污染2。

2. 基底膜水化：在鋪膠之前，需要對小室的基底膜進行水化處理，一般加入無血清培養(yǎng)液在 37℃溫育一段時間，為細胞的遷移和侵襲提供適宜的環(huán)境。

3. 細胞接種：細胞懸液的濃度要準(zhǔn)確調(diào)整，接種時要將細胞懸液均勻地加入到小室中，避免產(chǎn)生氣泡或細胞聚集。同時，要注意控制細胞的接種數(shù)量，過多或過少都會影響實驗結(jié)果。

4. 培養(yǎng)條件：根據(jù)細胞的特性和實驗需求，選擇合適的培養(yǎng)時間和培養(yǎng)條件，如溫度、二氧化碳濃度等。培養(yǎng)過程中要避免小室的晃動或移動，以免影響細胞的遷移和侵襲。

3. 數(shù)據(jù)記錄和分析：

1. 實驗記錄：詳細記錄實驗過程中的各項參數(shù)，如細胞類型、細胞數(shù)量、基質(zhì)膠濃度、培養(yǎng)時間等，以便后續(xù)分析和重復(fù)實驗。

2. 數(shù)據(jù)分析：采用合適的數(shù)據(jù)分析方法，對細胞穿過膜的數(shù)量進行統(tǒng)計和分析。可以使用直接計數(shù)法或間接計數(shù)法，但要注意操作的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。同時，要對實驗結(jié)果進行合理的解釋和討論，結(jié)合生物學(xué)背景和實驗?zāi)康?，判斷實驗結(jié)果的可靠性

【交付標(biāo)準(zhǔn)】

1.  實驗報告 

2. 真實實驗結(jié)果

3. 原始圖片

4. 實驗原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過周期，不予返還）

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