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【實(shí)驗(yàn)原理】

IP是利用固定在磁珠或瓊脂糖樹脂等固相支持物上的特異性抗體對(duì)抗原進(jìn)行親和純化的方法。基本原理是抗原-抗體特異性結(jié)合，檢測(cè)目的是富集分離蛋白。

Co-IP是IP的延伸，主要是用于探測(cè)兩個(gè)蛋白分子間是否存在特異性相互作用的一種方法。其原理是如果兩個(gè)蛋白在體外體系能夠發(fā)生特異性相互作用的話，那么當(dāng)用一種蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀時(shí)，另一個(gè)蛋白也會(huì)被同時(shí)沉淀下來?；驹硪彩强乖?抗體特異性結(jié)合，檢測(cè)目的是蛋白間相互作用。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

1、樣品裂解-裂解液；

2、樣品的預(yù)純化-normal IgG/微珠；

3、與目標(biāo)蛋白抗體共孵育-IP抗體、Normal IgG；

4、免疫共沉淀-微珠；

5、微珠清洗-裂解液；

6、洗脫；

7、WB 分析或其他分析-WB一抗、二抗。

【常見問題與注意事項(xiàng)】

1、高背景

A.可能原因：制備樣品中可能有不完全溶解的大的蛋白復(fù)合體。

對(duì)應(yīng)解決：制備樣品后進(jìn)行短暫超聲處理（3次，每次5秒鐘），離心純化，取上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

B.可能原因：洗滌不徹底。

對(duì)應(yīng)解決：多次洗滌，并逐漸增加洗滌緩沖液中的NaCl和去垢劑濃度。

C.可能原因：非特異性蛋白吸附于磁珠上。

對(duì)應(yīng)解決：進(jìn)行預(yù)處理以防止非特異性吸附。

D.可能原因：抗體本身特異性不好。

對(duì)應(yīng)解決：選擇合適的抗體，可以考慮單抗。

E.可能原因：使用了太多的抗體。

對(duì)應(yīng)解決：進(jìn)行條件優(yōu)化減少抗體。

F.可能原因：使用了過多的細(xì)胞或組織用于裂解。

對(duì)應(yīng)解決：減少細(xì)胞或組織量，推薦使用100-500 μg細(xì)胞裂解物。

G.可能原因：抗原降解。

對(duì)應(yīng)解決：保證樣品中加入了蛋白酶抑制劑，盡量使用新鮮制備的樣品。

2、無信號(hào)

A.可能原因：目的蛋白在樣本中表達(dá)量低或者不表達(dá)。

對(duì)應(yīng)解決：首先對(duì)目的蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，或者加大IP中加入的蛋白裂解物并進(jìn)行預(yù)處理。

B.可能原因：細(xì)胞裂解液使用不當(dāng)。

對(duì)應(yīng)解決：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇，慎重考慮。

C.可能原因：目的蛋白未被洗脫。

對(duì)應(yīng)解決：保證使用合適的洗脫液，保證洗脫液的強(qiáng)度和PH值合適。

D.可能原因：抗原降解。

對(duì)應(yīng)解決：保證樣品中加入了蛋白酶抑制劑，盡量使用新鮮制備的樣品。

E.可能原因：抗體沒有很好的與微珠相互結(jié)合。

對(duì)應(yīng)解決：選擇合適的微珠。

F.可能原因：抗體選擇不當(dāng)或者不工作。

對(duì)應(yīng)解決：利用WB對(duì)抗體進(jìn)行驗(yàn)證。

G.可能原因：抗體使用不足。

對(duì)應(yīng)解決：查閱文獻(xiàn)或者說明書，并多次優(yōu)化或選擇合適的抗體使用量。

3、假陽性

假設(shè)Co-IP實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組為“磁珠+抗X抗體+靶蛋白X+目的蛋白Y”，則可能出現(xiàn)的“假陽性”及對(duì)應(yīng)需要設(shè)置的實(shí)驗(yàn)對(duì)照如下所示：

4、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)失敗原因

A.可能原因：樣品被蛋白酶降解。

對(duì)應(yīng)解決：添加蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)；所有操作保持 4℃以下冰上操作并防止凍融。

B.可能原因：抗體濃度太低。

對(duì)應(yīng)解決：調(diào)整 IP 和/或 IB 抗體濃度， 必要時(shí)設(shè)立濃度梯度，摸索最佳濃度。

C.可能原因：抗體親合力太低。

對(duì)應(yīng)解決：選用適合于 IP 和/或 IB 的相應(yīng)抗體。

D.可能原因：IP 抗體未與珠子結(jié)合。

對(duì)應(yīng)解決：選用適合于 IP 的相應(yīng)珠子， 正確保存防止變質(zhì)或干燥。

E.可能原因：Tag未暴露在融合蛋白構(gòu)象的表面。

對(duì)應(yīng)解決：改變 tag 融合表達(dá)部位。

F.可能原因：裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太高。

對(duì)應(yīng)解決：改用低嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液。

【交付標(biāo)準(zhǔn)】

1. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告 

2. 真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 原始圖片

4. 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過周期，不予返還）

康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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