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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。

【實(shí)驗(yàn)介紹】

   Co-IP主要用于檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用，是IP實(shí)驗(yàn)的一種擴(kuò)展， 基于IP反應(yīng)的潛力，在樣品溶液中捕獲和純化主要目標(biāo)（抗原等）及通過天然相互作用靶標(biāo)結(jié)合的其他的大分子。此外，還可以利用Co-IP來確定在不同條件下的蛋白質(zhì)相互作用。
   CO-IP的應(yīng)用場景主要是：
   1、用于研究蛋白質(zhì)復(fù)合體成分（通過IP級抗體直接捕獲目的蛋白族群，或通過構(gòu)建帶標(biāo)簽的目的蛋白融合表達(dá)載體并通過標(biāo)簽蛋白的IP抗體進(jìn)行免疫捕獲。常與western blot和蛋白質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行IP產(chǎn)物分析）。

   2、用于檢測生理狀態(tài)下存在的蛋白質(zhì)互作關(guān)系。

   3、 用于檢測蛋白質(zhì)的修飾狀態(tài)，如泛素化。

【技術(shù)原理】

免疫共沉淀是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌的Protein G或A能特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段的方法。其基本原理是在細(xì)胞裂解液中加入感興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于磁珠的Protein G或A，若細(xì)胞中存在與興趣蛋白相結(jié)合的目的蛋白，就可以形成蛋白復(fù)合物：“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—Protein G或A”；最后通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)來檢測目的蛋白。

【實(shí)驗(yàn)流程】

【技術(shù)總結(jié)】

  1、實(shí)驗(yàn)樣品制備方法準(zhǔn)備：很重要！根據(jù)研究目的，檢測樣品可能是組織樣品，也可能是細(xì)胞樣品，不同樣品制備流程不太相同，目的蛋白表達(dá)量也有較大差別，必須選擇合適的樣品和樣品制備方法。

  2、根據(jù)研究目的選擇適合的蛋白特異性抗體：非常重要！用于Co-IP實(shí)驗(yàn)的抗體是針對目的蛋白的特異性抗體，最理想的是選擇一種能識別興趣蛋白質(zhì)某個表位的抗體，且這個表位不會被任何其他蛋白質(zhì)相互作用所掩蓋，比普通WB抗體要求高出很多；同時，抗體特異性和靈敏性盡可能高，才有可能有干凈的背景和較好的IP效果，所以必須選擇最適合的抗體用于Co-IP實(shí)驗(yàn)。

【注意事項(xiàng)】

1、細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP-40 或 Triton- X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定；

2、不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑；

3、使用對照抗體：單克隆抗體：正常小鼠的 IgG 或另一類單抗;兔多克隆抗體：正常兔 IgG；

4、確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；

5、要確?？贵w的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀；

6、確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。