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【實(shí)驗(yàn)原理】

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（Cell scratch assay）是通過在細(xì)胞單層上劃痕并通過延時(shí)顯微鏡定期捕獲圖像，從而研究細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)、修復(fù)能力和細(xì)胞間相互作用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，基本原理是：在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個(gè)空白區(qū)域，稱為“劃痕/傷口”，劃痕邊緣的細(xì)胞會(huì)逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕/傷口”愈合，于細(xì)胞遷移過程中在開始和定期捕獲圖像，通過測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕間距并計(jì)算差值，可對(duì)細(xì)胞的遷移能力做出判斷。因其類似體外傷口愈合過程，又名傷口愈合實(shí)驗(yàn)(Wound healing assay)?？捎糜诳梢杂^察藥物、基因等外源因素對(duì)細(xì)胞遷移、修復(fù)和相互作用的影響。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

1. 劃線：先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃?rùn)M線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線；

2. 鋪板：處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板；細(xì)胞鋪板6w/孔，接種原則為過夜后融合率達(dá)到100%，每孔最終的培養(yǎng)基總量2mL；

3. 細(xì)胞培養(yǎng)37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；

4. 劃痕：第二天用200微升槍頭比著6孔板蓋子或直尺，平行或垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜；

5. 清洗：PBS沖洗細(xì)胞3次，除去劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基；

6. 拍照：擦去6孔板背后的marker橫線劃痕。4倍鏡下進(jìn)行拍照，保證劃痕居中且垂直，注意背景一致，加入待測(cè)樣本，設(shè)置濃度梯度，可按0，6，12，24h時(shí)間點(diǎn)取樣，拍照。

7. 結(jié)果分析，使用Image J軟件打開圖片后，隨機(jī)劃取6至8條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值或者劃痕面積均值。

8. 數(shù)據(jù)處理：

細(xì)胞遷移率(傷口愈合率)=(初始劃痕面積-t時(shí)刻劃痕面積)/初始劃痕面積

細(xì)胞遷移率(傷口愈合率)=(初始細(xì)胞間距離均值-t時(shí)刻細(xì)胞間距離均值)/初始細(xì)胞間距離均值

【常見問題與注意事項(xiàng)】

1. 劃線的目的只是為了輔助劃痕時(shí)劃的更直，有利于后續(xù)拍照分析，劃線會(huì)在拍照前擦去。

2. 細(xì)胞接種數(shù)量需根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度和狀態(tài)而定，接種原則為過夜后融合率達(dá)到100%，即細(xì)胞間沒有空隙，否則會(huì)影響后續(xù)拍照分析。

3. 同濃度不同孔之間劃痕最好使用同一只槍頭，減少劃痕距離的誤差。劃痕時(shí)槍頭垂直，不能傾斜，可比著直尺或孔板蓋，保持力度一致，一次性劃完。

4. 沖洗時(shí)要溫柔，貼壁加入，避免沖掉單層細(xì)胞，反復(fù)多次沖洗，盡量洗掉所有的細(xì)胞碎片。

5. 降低細(xì)胞增殖對(duì)遷移造成的假陽性結(jié)果的方法：①使用無血清或低血清培養(yǎng)基(<2%)可降低細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；②一般認(rèn)為24h為細(xì)胞的一個(gè)周期，在選取合適的時(shí)間點(diǎn)(6，12，24h)檢測(cè)劃痕寬度時(shí)，最好不要超過細(xì)胞一個(gè)周期的時(shí)間；③如果要單純考慮細(xì)胞遷移，可以先用絲裂霉素(1μg/ml)處理1h，抑制細(xì)胞的分裂。

6. 盡量保證各個(gè)劃痕寬度一致, 人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這也是該方法最大的缺陷，有條件的同學(xué)可以選擇culture Insert（如下圖），將細(xì)胞接種于Dish中間的Insert，培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿Insert區(qū)域后用鑷子移除Insert即可產(chǎn)生500um、1000um寬度的劃痕。

【交付標(biāo)準(zhǔn)】

1.  實(shí)驗(yàn)報(bào)告 

2. 真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 原始圖片

4. 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過周期，不予返還）

康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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