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【實(shí)驗(yàn)原理】

蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)蛋白質(zhì)組的研究，研究不同的蛋白質(zhì)之間如何相互作用以及它們?cè)谏矬w內(nèi)發(fā)揮的作用。雖然蛋白質(zhì)的表達(dá)可以通過(guò)研究mRNA的表達(dá)來(lái)推斷，mRNA是基因和蛋白質(zhì)之間的中間人，但mRNA的表達(dá)水平并不總是與蛋白質(zhì)的表達(dá)水平有很好的相關(guān)性[1,3]。此外，對(duì)mRNA的研究并不考慮蛋白質(zhì)的翻譯后修飾、裂解、復(fù)合物的形成和定位，或可以產(chǎn)生的許多變體mRNA轉(zhuǎn)錄本；所有這些都是蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

1. 樣品準(zhǔn)備和處理，提取蛋白質(zhì)。

2. 蛋白質(zhì)酶解，將蛋白質(zhì)切割為肽段。

3. 質(zhì)譜檢測(cè)，得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

4. 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的鑒定和定量信息。

【常見(jiàn)問(wèn)題與注意事項(xiàng)】

1、蛋白樣品不能反復(fù)凍融；
2、蛋白樣品應(yīng)加蛋白酶抑制劑，以增加蛋白的穩(wěn)定性（建議最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑）；
3、細(xì)胞水平要做Western Blot，一般地5×106個(gè)細(xì)胞提取的蛋白夠就足Western Blot；
4、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，建議提取后最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性；
5、若轉(zhuǎn)膜不完全，可以加大上樣量，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用降低電流延長(zhǎng)時(shí)間，轉(zhuǎn)膜液中甲醇的比例多加5－10％；
6、如果上樣量超載，可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的 comb；
7、蛋白變性后，－80℃，一兩年沒(méi)有問(wèn)題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)；
8、脫脂奶粉中含生物素，如果實(shí)驗(yàn)中有涉及到“生物素”請(qǐng)將封閉液改為BSA封閉；
9、做200kd以上蛋白的Western Blot時(shí)要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）；
10、蛋白的上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)定，如果要求是定量和半定量的Western Blot則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒(méi)有太大的關(guān)系，盡量多上就行了，但是不要超過(guò)0.3μg/mm2；
11、一抗，二抗的比例是比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底；12、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？
解答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱(chēng)表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說(shuō)明書(shū)上都有注明此種抗體識(shí)別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗）；
13、抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融；
14、NC膜 PVDF膜 尼龍膜的差異。
尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類(lèi)型；硝酸纖維素膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，價(jià)格最便宜；PVDF膜介于二者之間。
就結(jié)合能力而言：尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)480－600μg/cm2，可結(jié)合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)80－100μg/cm2，對(duì)于200bp的核酸片段結(jié)合能力不強(qiáng)；PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)125－300μg/cm2。
就溫度適應(yīng)性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA，結(jié)合不牢固；PVDF膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。
就韌性而言：尼龍膜較強(qiáng)；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強(qiáng)。
就重復(fù)性而言：尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交，雜交后，探針?lè)肿涌山?jīng)堿變性被洗脫下來(lái)；硝酸纖維素膜不能重復(fù)使用；PVDF膜可以重復(fù)使用。
15、在做Western Blot時(shí)，PVDF膜用甲醇浸泡的目的。
PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。

【交付標(biāo)準(zhǔn)】

1. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告 

2. 真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 原始圖片

4. 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過(guò)周期，不予返還）

康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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