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【實(shí)驗(yàn)原理】

通過將外源DNA/shRNA克隆到帶有某種抗性基因的載體上，重組載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞并整合到其染色體中，并隨細(xì)胞分裂穩(wěn)定傳遞，最后用載體中所含抗性基因進(jìn)行篩選。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

第一步：篩選濃度測定，以10~14 天細(xì)胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度；

第二步：進(jìn)行細(xì)胞接種，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到60%~80% 覆蓋；

第三步：進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染

第四步：利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進(jìn)行篩選，并鑒定篩選結(jié)果。

方法二：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。慢病毒可以攜帶外源基因隨機(jī)整合進(jìn)基因組。轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定細(xì)胞株的效率高，是建立穩(wěn)定株的最優(yōu)方式。

第一步：將人源化的抗體基因轉(zhuǎn)接到慢病毒載體上，

第二步：使用包裝細(xì)胞，一般為293細(xì)胞，包裝出病毒，不同類型病毒包裝時(shí)間一般在3-5天。

第三步：用病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。包裝好的病毒要先測滴度，根據(jù)滴度決定轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞的病毒量。

第四步：后期篩選。轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞1-2天后加抗生素篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞株。

【常見問題與注意事項(xiàng)】

1、篩選前的準(zhǔn)備

篩選前我們需要確定藥物篩選的相關(guān)濃度。對于不同的細(xì)胞來說，對藥物的敏感度是各不相同的，需要在細(xì)胞能夠承受的濃度范圍內(nèi)，否則，很容易造成細(xì)胞表達(dá)低甚至死亡的情況,

2、篩選過程中的注意事項(xiàng)

司一般在72小時(shí);篩選時(shí)間:一般在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)后進(jìn)行，而對于慢病毒來說加藥時(shí)

包的變化情況;空白對照:在加藥篩選時(shí)，需要提前設(shè)置好空白對照，全程對比細(xì)

換液操作:當(dāng)細(xì)胞死亡達(dá)到一定的程度后，需要及時(shí)換液，以避避免,害物質(zhì)造成細(xì)胞的死亡,3、克隆篩選過程中的注意事項(xiàng)

在進(jìn)行單克隆篩選的時(shí)候，如果有熒光標(biāo)記，則盡量選擇那些帶有光較強(qiáng)的細(xì)胞;如果質(zhì)粒不帶熒光標(biāo)記，則只能進(jìn)行盲挑。當(dāng)然了，無論是否帶有熒光標(biāo)記，都需要對其進(jìn)行驗(yàn)證，而且盡量多挑幾個(gè)來進(jìn)行克隆，以保證成功率。

【交付標(biāo)準(zhǔn)】

1. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告 

2. 真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 原始圖片

4. 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過周期，不予返還）

康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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