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線粒體——細胞的“能量中樞”與“命運開關(guān)”

在微觀的細胞世界中，線粒體不僅是制造能量的“發(fā)電廠”（95%的ATP由此產(chǎn)生），更是調(diào)控生死決策的“指揮中心”。當(dāng)線粒體功能健全時，它們通過膜電位（ΔΨm） 驅(qū)動ATP合成、鈣穩(wěn)態(tài)與信號傳導(dǎo)；一旦功能崩潰（如凋亡、疾病中），則會觸發(fā)活性氧（ROS）爆發(fā)與線粒體網(wǎng)絡(luò)解體——這些變化如同細胞命運的“早期警報”。

為什么需要精準(zhǔn)檢測線粒體？

1. 功能監(jiān)控（ΔΨm）：

? 膜電位是線粒體健康的“電壓表”，其崩潰（如JC-1紅綠比↓或TMRE熒光↓）是凋亡/壞死的最早標(biāo)志。

2. 結(jié)構(gòu)評估（質(zhì)量）：

? MitoTracker Green FM標(biāo)記總線粒體池，揭示線粒體數(shù)量增減與形態(tài)異變（腫脹/碎片化），是“細胞器人口普查”的金標(biāo)準(zhǔn)。

3. 危機預(yù)警（ROS）：

? DCFH-DA捕捉整體氧化風(fēng)暴，MitoSOX Red精準(zhǔn)定位線粒體超氧陰離子，為氧化損傷提供“分子雷達”。

一、線粒體膜電位檢測

線粒體膜電位（ΔΨm）是維持線粒體功能（如ATP合成、鈣離子緩沖、活性氧產(chǎn)生和凋亡信號傳導(dǎo)）的關(guān)鍵驅(qū)動力。檢測其變化對于研究細胞能量代謝、細胞凋亡、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、癌癥等至關(guān)重

JC-1染料

核心原理：濃度依賴的熒光轉(zhuǎn)換

? JC-1 是一種獨特的“雙發(fā)射”親脂性陽離子染料。? 低 ΔΨm（或低染料濃度）時： JC-1 主要以單體形式存在于細胞質(zhì)中，發(fā)出綠色熒光（最大激發(fā)/發(fā)射波長約 510 nm / 527 nm）。? 高 ΔΨm 時： 由于線粒體基質(zhì)帶負電，帶正電的JC-1 被大量攝取并在線粒體基質(zhì)內(nèi)積累。當(dāng)濃度足夠高時，JC-1 分子會聚集成 J-聚集體 (J-aggregates)。J-聚集體發(fā)出紅色熒光（最大激發(fā)/發(fā)射波長約 585 nm / 590 nm）。? 關(guān)鍵指標(biāo)： 檢測的是 紅色熒光（聚集體）與綠色熒光（單體）的強度比值 (Red/Green Ratio)。這個比值與ΔΨm 高度正相關(guān)：比值越高，ΔΨm 越高；比值越低，ΔΨm 越低。

主要優(yōu)點：

1. 比值法抗干擾性強： 這是JC-1最大的優(yōu)勢。比值測量能有效抵消因細胞大小、形狀、染料裝載效率、探針濃度、儀器設(shè)置（如激光功率、PMT電壓）差異以及光程差異（在顯微鏡下）等因素引起的誤差。結(jié)果更可靠，定量性更好。2. 可視化清晰： 在熒光顯微鏡下，高ΔΨm的細胞/線粒體呈現(xiàn)明亮的紅色（聚集體）和較弱的綠色（單體）；低ΔΨm時則呈現(xiàn)明亮的綠色（單體）和微弱的紅色（或無紅色）。這種顏色變化非常直觀，易于識別細胞群體內(nèi)或單個細胞內(nèi)的異質(zhì)性（如凋亡細胞vs健康細胞）。3. 廣泛用于凋亡研究： ΔΨm崩潰是細胞凋亡早期的關(guān)鍵事件，JC-1比值下降是檢測凋亡啟動的經(jīng)典標(biāo)志。

主要缺點：

1. 優(yōu)化要求高： 探針濃度、孵育時間、溫度必須針對每種細胞類型嚴(yán)格優(yōu)化。濃度過低無法形成足夠聚集體，濃度過高可能導(dǎo)致單體熒光飽和或非特異性染色。2. 聚集體形成動力學(xué)： J-聚集體的形成并非瞬間完成，且在某些細胞類型或條件下（如線粒體膜成分改變）可能不完全，影響比值準(zhǔn)確性。3. 光穩(wěn)定性相對較差： 相較于TMRE，JC-1（尤其是紅色聚集體）更容易發(fā)生光漂白，在長時間活細胞成像或需要高激光強度的共聚焦成像中受限。4. 光譜串?dāng)_： 需要仔細設(shè)置濾光片，確保綠色和紅色通道之間有良好的分離，避免串色（Bleed-through）。5. 潛在毒性： 較高濃度或長時間孵育可能對某些細胞有毒性。

典型應(yīng)用：

? 流式細胞術(shù)高通量檢測細胞群體ΔΨm變化（如藥物篩選、毒性測試）。? 熒光顯微鏡（尤其是寬場）觀察ΔΨm在細胞群體或單個細胞內(nèi)的分布和異質(zhì)性。? 細胞凋亡的早期檢測（核心應(yīng)用）。? 評估線粒體功能狀態(tài)。

TMRE染料

核心原理：電位依賴的熒光積累

? TMRE 是一種單發(fā)射的親脂性陽離子染料（屬于羅丹明家族）。? 其熒光強度（橙紅色，最大激發(fā)/發(fā)射波長約 550nm / 576 nm）直接與線粒體攝取積累的染料量成正比。? 由于染料積累量由線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的電位差（ΔΨm）驅(qū)動（遵循能斯特方程），因此熒光強度（平均熒光強度 - MFI）與 ΔΨm 正相關(guān)：熒光越強，ΔΨm 越高；熒光越弱，ΔΨm 越低。

主要優(yōu)點：

1. 優(yōu)異的光穩(wěn)定性： TMRE 的光穩(wěn)定性非常好，特別適合長時間的活細胞動態(tài)成像，尤其是在共聚焦顯微鏡或高內(nèi)涵成像系統(tǒng)上進行時間序列拍攝（Time-lapse）。2. 低細胞毒性： 在推薦的工作濃度下，TMRE 對細胞的毒性通常很低，對細胞生理狀態(tài)干擾小，是活細胞成像的首選之一。3. 泄漏速率較慢：TMRE 從線粒體中泄漏的速度較慢，能更好地維持穩(wěn)態(tài)熒光信號，利于動力學(xué)觀察。4. 使用相對簡單： 原理直觀，操作流程相對標(biāo)準(zhǔn)化。5. 適合高分辨率成像： 與共聚焦、雙光子顯微鏡兼容性好，能提供清晰的線粒體亞細胞定位圖像。

主要缺點：

1. 依賴絕對熒光強度： 這是單色探針的主要局限。熒光強度受多種因素影響：

? 染料濃度： 必須精確控制并保持一致。? 裝載效率： 受細胞類型、活力、孵育條件影響。? 細胞大小/形態(tài)/線粒體數(shù)量： 大細胞或線粒體豐富的細胞本底熒光更高。? 儀器設(shè)置： 激光功率、PMT增益、曝光時間等直接影響讀數(shù)。? 光程/聚焦： 顯微鏡下不同焦平面或細胞厚度影響光強度。

2. 嚴(yán)格的對照需求： 為了準(zhǔn)確解釋結(jié)果，必須設(shè)置有效的陽性和陰性對照：

? 陰性對照 (ΔΨm 完全崩潰)： 通常在實驗結(jié)束時加入線粒體解偶聯(lián)劑（如 CCCP 或 FCCP，常用濃度 10-50 μM，孵育 5-30 分鐘），使所有細胞的熒光降至最低基線水平（代表背景/非電位依賴的染色）。實驗中細胞的MFI需要與這個對照值比較。? 陽性對照/未處理組： 健康細胞作為高ΔΨm的基準(zhǔn)。

3. 無法直觀顯示異質(zhì)性

? 不像JC-1有顏色變化，TMRE的單色信號在顯微鏡下不易直接目視區(qū)分ΔΨm高低（除非結(jié)合圖像分析軟件測量強度）。

典型應(yīng)用：

? 活細胞實時成像（核心優(yōu)勢）： 共聚焦/雙光子顯微鏡下監(jiān)測單個細胞或細胞群ΔΨm的動態(tài)變化過程（如藥物處理、代謝刺激、鈣信號等引起的快速或慢速波動）。? 流式細胞術(shù)檢測ΔΨm（需結(jié)合CCCP對照進行數(shù)據(jù)歸一化）。? 研究電興奮性細胞（如神經(jīng)元、心肌細胞）的線粒體功能，其對微環(huán)境變化敏感。? 需要長時間觀察的實驗。

二、線粒體質(zhì)量檢測

MitoTracker Green FM：線粒體特異性結(jié)構(gòu)標(biāo)記探針

MitoTracker Green FM（MTG） 是一種高性能熒光染料，專為精準(zhǔn)標(biāo)記細胞內(nèi)的總線粒體池而設(shè)計。其核心價值在于提供不依賴線粒體功能狀態(tài)的結(jié)構(gòu)性成像，成為研究線粒體質(zhì)量（Mass）的首選化學(xué)工具。

高選擇性與膜電位非依賴性

線粒體高度特異性：

? 通過優(yōu)化親脂性結(jié)構(gòu)，MTG選擇性蓄積于線粒體基質(zhì)，與胞內(nèi)其他細胞器（如溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）無交叉染色，信噪比顯著優(yōu)于普通染料。? 標(biāo)記全部線粒體：
染色不依賴線粒體膜電位（ΔΨm），可同時標(biāo)記健康（高ΔΨm）與功能障礙（低ΔΨm/腫脹/碎片化）的線粒體，真實反映總線粒體的數(shù)量與形態(tài)分布。

卓越熒光特性

特性    科學(xué)優(yōu)勢    

明亮綠色熒光    激發(fā)/發(fā)射峰≈490/523 nm，兼容    

高光穩(wěn)定性    抗光漂白能力優(yōu)異，支持長時間活細胞動態(tài)成像（如線粒體融合/分裂追蹤）    

超低背景    僅在疏水性線粒體脂質(zhì)環(huán)境發(fā)光    

三、ROS檢測

DCFH-DA：廣譜ROS探針（以H?O?為主）

檢測原理

1. 穿透與活化：

? 脂溶性DCFH-DA被動擴散進入細胞，被胞內(nèi)酯酶（Esterase）水解為極性分子 DCFH（2',7'-二氯二氫熒光素），無法穿出細胞膜。

2. 氧化與發(fā)光：

? DCFH被ROS（主要是H?O?，也可被?OH/ONOO?氧化） 氧化生成 DCF（2',7'-二氯熒光素）。? 發(fā)射綠色熒光（最大激發(fā)/發(fā)射波長：Ex ≈ 488 nm, Em ≈ 525 nm），強度與ROS水平正相關(guān)。

適用場景

? 細胞整體ROS水平初篩（如藥物/環(huán)境毒素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激）。? 流式細胞術(shù)高通量檢測（如免疫細胞呼吸爆發(fā)）。? 與線粒體/溶酶體探針聯(lián)用（需避免光譜重疊）。

優(yōu)點 vs 缺點

優(yōu)點    缺點    

操作簡單，成本低廉    特異性低    

兼容常規(guī)流式/FITC濾光片    光漂白強    

可半定量比較不同處理組    自發(fā)氧化    

pH敏感性    熒光強度受胞內(nèi)pH影響    

MitoSOX? Red：線粒體超氧陰離子（O???）特異性探針

檢測原理

1. 靶向蓄積：

? 修飾的二氫乙錠（DHE）衍生物，帶親脂性三苯基膦陽離子（TPP?），通過線粒體膜電位（ΔΨm）定向富集到線粒體基質(zhì)。

2. 特異性氧化：

? 被線粒體內(nèi)的 超氧陰離子（O???） 氧化生成 2-羥基乙錠，與DNA結(jié)合后發(fā)射紅色熒光（最大激發(fā)/發(fā)射波長：Ex ≈ 510 nm, Em ≈ 580 nm）。

適用場景

? 線粒體特異性O(shè)???檢測（如凋亡、缺血再灌注損傷、神經(jīng)退行性疾病）。? 活細胞共聚焦動態(tài)成像（觀察線粒體ROS時空變化）。? 評估線粒體靶向抗氧化劑效果（如MitoQ、SkQ1）。

優(yōu)點 vs 缺點

優(yōu)點    缺點    

精準(zhǔn)定位線粒體    價格昂貴（約為DCFH-DA的10倍）    

對O???特異性高    （強于DHE）    

光穩(wěn)定性優(yōu)于DCFH-DA    部分細胞類型可能滯留胞質(zhì)（需優(yōu)化濃度）    

兼容TRITC/PE濾光片    高濃度可能抑制線粒體呼吸鏈    

四、文獻應(yīng)用實例

實例1：流式細胞術(shù)分析線粒體膜電位，質(zhì)量以及ROS水平

文章段落呈現(xiàn)

1.重懸與染色

將細胞沉淀重懸于 100 μl 1× 結(jié)合緩沖液（BD Bioscience 產(chǎn)品）中，加入以下熒光染料及抗體使得工作濃度達到相應(yīng)要求：

? 線粒體標(biāo)記：Mitotracker Green-FM（100 nM，綠色熒光，標(biāo)記線粒體）；? 活性氧（ROS）檢測：H?DCFDA（1 μM，進入細胞后被 ROS 氧化發(fā)出綠色熒光）；? 線粒體膜電位（MMP）檢測：TMRE（100 nM，紅色熒光，依賴膜電位積聚于線粒體）；? 細胞表面標(biāo)志物抗體：? CD45-FITC（綠色熒光，標(biāo)記白細胞共同抗原）；? CD11b-PE（橙色熒光，標(biāo)記單核細胞 / 巨噬細胞 / 小膠質(zhì)細胞）；? GLAST-APC（紅色熒光，標(biāo)記星形膠質(zhì)細胞），均按 1:100 稀釋。? 孵育條件：避光孵育 15 分鐘，隨后加入 200 μl 1× PBS 稀釋。

2.流式細胞術(shù)分析

? 檢測參數(shù)：每樣本采集 10,000 個事件，通過流式細胞儀分析各熒光通道的信號強度，分別量化線粒體質(zhì)量（Mitotracker Green）、ROS 水平（H?DCFDA）、MMP（TMRE）及細胞分型（CD45/CD11b/GLAST）。

參考文獻[1]:Navarro E, Gonzalez-Lafuente L, Pérez-Liébana I, et al. Heme-Oxygenase I and PCG-1α Regulate Mitochondrial Biogenesis via Microglial Activation of Alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptors Using PNU282987. Antioxid Redox Signal. 2017;27(2):93-105. doi:10.1089/ars.2016.6698

實例2：流式細胞數(shù)分析線粒體膜電位（MMP）與線粒體質(zhì)量

文章段落呈現(xiàn)

1. 試劑與細胞準(zhǔn)備

? 細胞株：K562G、K562R 細胞。? 染色試劑：? JC-1 試劑（2 μM，貨號 #HY-15534，品牌#MedChemExpress），用于檢測線粒體膜電位。? MitoTracker Green（0.1 μM，貨號 #HY-135056，品牌#MedChemExpress），用于標(biāo)記線粒體質(zhì)量。

2. 染色操作流程

? 分組染色：? MMP 檢測：取細胞懸液，加入 JC-1 試劑（終濃度 2 μM），37℃避光孵育 30 分鐘。? 線粒體質(zhì)量檢測：另取細胞懸液，加入 MitoTracker Green（終濃度 0.1 μM），37℃避光孵育 30 分鐘。? 洗滌與重懸：孵育結(jié)束后，用 PBS 洗滌細胞 2 次，1000 rpm 離心 5 分鐘，棄上清，重懸于 500 μL PBS 中。

3. 流式細胞術(shù)分析

? 儀器參數(shù)：使用流式細胞儀（如 BD LSR II），設(shè)置 488 nm 激光激發(fā)：? JC-1 檢測：收集 530 nm（綠色，單體）和 590 nm（紅色，聚集體）熒光信號，計算紅綠熒光比值。? MitoTracker Green 檢測：收集 516 nm 綠色熒光信號，量化線粒體質(zhì)量。
參考文獻[2]：Feng L, Ding R, Qu X, et al. BCR-ABL triggers
a glucose-dependent survival program during leukemogenesis through the
suppression of TXNIP.Cell Death Dis. 2023;14(4):287. Published 2023 Apr 24. doi:10.1038/s41419-023-05811-2

實例3：流式細胞術(shù)分析線粒體活性氧（ROS）和膜電位

文章段落呈現(xiàn)

Figure 3A-B：線粒體 ROS 檢測（MitoSOX 染色）

實驗設(shè)計與目的

? 檢測指標(biāo)：線粒體超氧化物（ROS）水平，驗證 ACLY 抑制劑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。? 處理條件：35μM或70 μM ACLY 抑制劑處理 THP-1 細胞 3，6，9，12 小時。

試劑準(zhǔn)備：

? MitoSOX? Red（品牌：Thermo Fisher Scientific,貨號：M36008）用無血清培養(yǎng)基稀釋至 5 μM 終濃度。

細胞處理：

1. 收集處理 3，6，9，12 小時的細胞，1500 rpm 離心 5 分鐘，PBS 洗滌 1 次。2. 重懸于無血清培養(yǎng)基，加入 5 μM MitoSOX? Red，37℃避光孵育 10 分鐘。3. 預(yù)冷 PBS 洗滌 2 次，重懸于 1% FBS-PBS，立即上樣流式細胞儀。

檢測參數(shù)：

? 流式細胞儀：BD LSR II，488 nm 激光激發(fā)，PE檢測通道（580 nm 發(fā)射光檢測紅色熒光）。? 數(shù)據(jù)分析：FlowJo v10.9.0，計算高 ROS 細胞群（MitoSOX 高熒光）的比例。

3. 關(guān)鍵結(jié)果

? 70 μM ACLY 抑制劑處理后，高 ROS 細胞比例從 0 小時的約 10% 升至 12 小時的 40%，證實 ROS 顯著積累。

Figure 3C-D：線粒體膜電位（MMP）檢測（TMRE 染色）

實驗設(shè)計與目的

? 檢測指標(biāo)：線粒體膜電位（ΔΨm），驗證 ACLY 抑制劑誘導(dǎo)的 MMP 損傷。? 處理條件：70 μM ACLY 抑制劑處理 THP-1 細胞 6 小時。

試劑準(zhǔn)備：

? TMRE（品牌：MedChemExpress, 貨號：HY-D0985A）用無血清培養(yǎng)基稀釋至 100 nM 終濃度。

細胞處理：

1. 收集處理 6 小時的細胞，1500 rpm 離心 5 分鐘，PBS 洗滌 1 次。2. 重懸于無血清培養(yǎng)基，加入 100 nM TMRE，37℃避光孵育 15 分鐘。3. 預(yù)冷 PBS 洗滌 2 次，重懸于含 1% FBS-PBS，立即檢測。

檢測參數(shù)：

? 流式細胞儀：BD LSR II，488 nm 激光激發(fā)，PE檢測通道（575 nm發(fā)射光檢測紅色熒光）。? 數(shù)據(jù)分析：FlowJo v10.9.0，計算低 MMP 細胞群（TMRE 低熒光）的比例。

關(guān)鍵結(jié)果

? 70 μM ACLY 抑制劑處理 6 小時后，低 MMP 細胞比例從 0 小時的約 5% 升至 30%，表明 MMP 顯著降低。
參考文獻[3]:Watanabe A, Tipgomut C, Totani H, et al. Noncanonical TCA cycle fosters canonical TCA cycle and mitochondrial integrity in acute myeloid leukemia. Cancer Sci. 2025;116(1):152-163. doi:10.1111/cas.16347

實例4流式細胞術(shù)分析線粒體ROS，膜電位，質(zhì)量

文章段落呈現(xiàn)

 線粒體膜電位（ΔΨm）檢測

方法：

? 染料：使用 TMRE（Tetramethylrhodamine ethyl ester）（貨號 HY-D0985A，品牌 MedChemExpress）。

步驟：

  1. 將細胞（2 × 10?）接種于12孔板，順鉑處理24小時。                                                                                                                                                                                        2. 加入100 nM TMRE染色液，避光孵育30分鐘。                                                                                                                                                                                                3. PBS洗滌2次。                                                                                                                                                                                                                                                4. 使用流式細胞儀（BD Accuri? C6）或共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM800）檢測熒光強度。

結(jié)果展示：

線粒體ROS檢測

方法：

? 染料：MitoSOX? Red Mitochondrial Superoxide Indicator（貨號 M36008，品牌 Thermo Fisher Scientific）。

步驟：

1. 順鉑處理細胞24小時。2. 收集細胞，用HBSS緩沖液洗滌。3. 加入5 μM MitoSOX染料，37°C避光孵育10分鐘。4. HBSS洗滌2次。5. 流式細胞儀（BD Accuri? C6）檢測紅色熒光（激發(fā)/發(fā)射波長：510/580 nm）。

結(jié)果展示

? ROS水平以相對熒光強度表示（*P < 0.05）。

線粒體質(zhì)量檢測

方法：

? 染料：MitoTracker Green FM（貨號 M7514，品牌 Invitrogen)）。

步驟：

1. 細胞用PBS重懸。2. 加入100 nM MitoTracker Green，37°C避光孵育30分鐘。3. PBS洗滌2次。4. 流式細胞儀檢測綠色熒光（激發(fā)/發(fā)射波長：490/516 nm）。

結(jié)果展示：

參考文獻[4]:Zheng ZY, Yang PL, Li RY, et al. STAT3β disrupted mitochondrial electron transport chain enhances chemosensitivity by inducing pyroptosis in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 2021;522:171-183. doi:10.1016/j.canlet.2021.09.035

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