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Western Blot

作為基礎(chǔ)生命科學(xué)檢測方法之一，目前已經(jīng)有適配性較高的通用型實(shí)驗(yàn)檢測方案和流程。

但蛋白質(zhì)作為一個特異性較強(qiáng)的檢測指標(biāo)，總會有一些并不適用于常規(guī)方法，且需要我們對實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化或者修改，才能保證得到較為理想的結(jié)果。

如果你研究的蛋白分子量較大或較小，且苦于一直跑不出好看的WB結(jié)果，那么這篇文章一定可以幫到你！

WB實(shí)驗(yàn)一般流程

什么是大/小分子蛋白

1）大分子蛋白

大分子蛋白一般指WB檢測中分子量＞200kDa的蛋白質(zhì)，由于其分子量大，遷移速度慢，轉(zhuǎn)膜困難等特征，這類蛋白質(zhì)的遷移和轉(zhuǎn)移可能會受到影響，因而在WB實(shí)驗(yàn)中有時難以獲得清晰條帶。

2）小分子蛋白

小分子蛋白主要指WB檢測中分子量＜20kDa的蛋白質(zhì)，由于分子量小易降解，且?guī)щ姾闪恳蚕鄬^少，所以導(dǎo)致其吸附能力比較弱，所以常用的蛋白WB步驟通常會導(dǎo)致檢測結(jié)果不穩(wěn)定，時有時無，甚至出現(xiàn)轉(zhuǎn)膜失敗、蛋白彌散等完全看不到目標(biāo)條帶的情況。

針對大/小分子蛋白的WB檢測，應(yīng)該對實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

大分子蛋白實(shí)驗(yàn)步驟優(yōu)化

1）樣品制備

大分子量蛋白在提取時會比較困難。很多大分子量蛋白為膜蛋白，膜蛋白屬于非可溶性蛋白，且表達(dá)量通常較低，一般使用溶液法（RIPA等）裂解時，通常會丟失在不可溶組分中，所以要選擇合適的方法來進(jìn)行蛋白的提取或富集。提取總蛋白時建議適當(dāng)延長裂解時間，有助于大分子量蛋白的充分裂解。 

2）凝膠上樣、電泳

① 凝膠制備

主要有Tris-Glycine, Bis-Tris and, Tris-Acetate3種：Tris-Glycine凝膠的PH為8.6，Bis-Tris凝膠的PH為6.4，Tris-Acetate 凝膠的PH為7。

經(jīng)驗(yàn)分享：這里推薦使用Tris-Acetate 凝膠跑大分子蛋白，會呈現(xiàn)更高的分辨率。凝膠濃度與孔徑成反比，即凝膠濃度越小，孔越大，較大分子量的蛋白質(zhì)更容易通過，所以建議使用6-8％濃度的分離膠，當(dāng)然有條件也可以使用梯度凝膠。

② 電泳技術(shù)

丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。

它有兩種形式：SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）及非變性聚丙烯酰胺凝膠（Native-PAGE）。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，形成一個三維網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)，它具有分子篩效應(yīng)。

③ 電泳電壓選擇

電泳時可采用120-150V的高電壓，在冰水浴中進(jìn)行，盡量使Marker拉開足夠大的距離，通常需要4h左右。

經(jīng)驗(yàn)分享：電壓120V，4 h，245KD Marker條帶差不多到分離膠中間位置，蛋白上樣緩沖液會漏到電泳槽，不要回收電泳液，以免污染下一次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

3）轉(zhuǎn)膜

① 膜的選擇

轉(zhuǎn)印膜一般有PVDF膜或NC膜。跑大分子蛋白選擇PVDF膜。如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜不需要在轉(zhuǎn)移buffer中添加甲醇，目的蛋白轉(zhuǎn)印的機(jī)會更高。

2種類型的膜都有各種孔徑尺寸，最常見的是0.2um和0.45um。與凝膠一樣，較大的蛋白比較小的更容易穿過大孔隙。大多數(shù)蛋白質(zhì)（> 20kDa）可以用0.45um膜轉(zhuǎn)移，避免使用0.2um孔徑。

② 切膠

濃縮膠不要切得太過，因?yàn)楹苡锌赡軛l帶就在濃縮膠和分離膠交界以下2mm處；有可能許多分子量超過250KDa的蛋白就殘留在濃縮膠中。

③ Transfer buffer（轉(zhuǎn)膜液）

Transfer buffer中的甲醇容易讓大分子量蛋白沉淀，所以減少Transfer buffer中甲醇百分比（10％或更低）來避免這種情況發(fā)生，并添加SDS至終濃度為0.1％，進(jìn)一步確保蛋白質(zhì)不會沉淀。

④ 轉(zhuǎn)膜方式

轉(zhuǎn)膜方式采用濕轉(zhuǎn)法與半干轉(zhuǎn)法（濕轉(zhuǎn)獲得條帶更好，半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜效率高） ，恒壓40V電壓，轉(zhuǎn)膜60-90min，一般小于400KDa的蛋白都能轉(zhuǎn)到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜中間也可以通過換冰保證低溫環(huán)境。

濕轉(zhuǎn)法所需條件（僅供參考）

半干轉(zhuǎn)法（僅供參考）

恒壓40V電壓，轉(zhuǎn)膜60-90min，一般小于400KDa的蛋白都能轉(zhuǎn)到PVDF膜上。恒流法轉(zhuǎn)，電流大小設(shè)置為PVDF膜的面積，轉(zhuǎn)1h左右即可，若怕轉(zhuǎn)膜過頭，可以嘗試將2張PVDF膜重疊起來（總會有一張膜上有條帶）。

⑤ 增加轉(zhuǎn)印時間

在正確的選擇完凝膠、轉(zhuǎn)印膜及轉(zhuǎn)移buffer后，轉(zhuǎn)印正式開始。因?yàn)榇蠓肿拥鞍邹D(zhuǎn)移時間很慢，推薦350-400mA轉(zhuǎn)移90min或 4°C；40mA，轉(zhuǎn)印過夜。

⑥ 成功結(jié)果圖分享

5）其他建議

① 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，可以使用麗春紅染液染膜，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)膜效率；如果染色后無條帶，則需考慮樣品問題及轉(zhuǎn)膜問題，進(jìn)行調(diào)整。

② 因?yàn)槎鄶?shù)大分子蛋白是膜蛋白，表達(dá)較少，建議適當(dāng)增加上樣量，并延長一抗孵育時間。

③ 大分子蛋白與PVDF膜的結(jié)合不是很牢固，容易脫落，洗膜時要操作輕柔，不要過于粗暴，否則抗原抗體復(fù)合物容易脫落。

6）案例分析

p300蛋白是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，大小為300kDa左右，被稱為組蛋白乙型丙酮乙酸轉(zhuǎn)移酶，是胞漿酶的一種。（p300在細(xì)胞核中發(fā)揮重要作用，參與許多細(xì)胞核過程的調(diào)節(jié)，包括基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)以及細(xì)胞增殖和分化等。）

實(shí)驗(yàn)分析：上樣量較多，分離膠濃度過高，跑膠以及轉(zhuǎn)膜時間短等原因?qū)е履繕?biāo)位置沒有條帶

7）常見問題&解析

① 蛋白質(zhì)遷移不完全或遷移位置不準(zhǔn)確

a.可能是由于電泳條件不當(dāng)，如電流過高或時間過短，可以嘗試調(diào)整電流和時間。

b.可能是由于堆積的蛋白質(zhì)太多，可以嘗試減少加載樣品的量。

c.可能是由于蛋白質(zhì)的大小超過了膜的遷移范圍，可以嘗試使用更大的膜或調(diào)整電泳條件。

② 背景信號過高

a.可能是由于非特異性結(jié)合，可以嘗試增加非特異性結(jié)合抑制劑，如牛血清白蛋白（BSA）。

b.可能是由于過度的洗滌步驟，可以嘗試減少洗滌次數(shù)或時間。

c.可能是由于次級抗體的過度使用，可以嘗試減少次級抗體的濃度或使用更高質(zhì)量的次級抗體。

③ 信號弱或無信號

a.可能是由于蛋白質(zhì)的濃度過低，可以嘗試增加加載樣品的量。

b.可能是由于抗體的濃度過低，可以嘗試增加抗體的濃度。

c.可能是由于抗體的選擇不當(dāng)，可以嘗試使用其他抗體。

d.可能是由于蛋白質(zhì)的修飾或結(jié)構(gòu)導(dǎo)致抗體無法識別，可以嘗試使用其他抗體或改變實(shí)驗(yàn)條件。

④ 帶狀模糊或分辨率不佳

a.可能是由于樣品的凈化不充分，可以嘗試使用更高純度的樣品。

b.可能是由于電泳條件不當(dāng)，如電流過高或時間過長，可以嘗試調(diào)整電流和時間。

c.可能是由于缺乏還原劑或變性劑，可以嘗試添加還原劑和變性劑。

⑤ 重復(fù)性差

a.可能是由于實(shí)驗(yàn)操作不一致，可以嘗試標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟。

b.可能是由于實(shí)驗(yàn)條件不穩(wěn)定，可以嘗試使用更穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)條件。

c.可能是由于實(shí)驗(yàn)儀器的問題，可以嘗試檢查和維護(hù)實(shí)驗(yàn)儀器。

小分子蛋白實(shí)驗(yàn)步驟優(yōu)化

1）凝膠上樣、電泳

① 上樣量

通常WB實(shí)驗(yàn)中每孔上樣量為30-50μg，80%蛋白在細(xì)胞中的含量很低，當(dāng)?shù)鞍追肿恿窟^小時，上樣量建議選擇50-100μg。畢竟對于小分子的蛋白來說，在跑電泳時，稍不留心，蛋白就跑沒影了。

② 凝膠濃度選擇

分子量越小的蛋白，需要的凝膠濃度越高，反之亦然。

如果是商品化的凝膠試劑盒通常各個廠家針對不同的濃度的凝膠都有對應(yīng)推薦用于分離的蛋白分子量，操作的時候仔細(xì)看說明書即可。

▲選擇合適膠濃度，分子量小的蛋白，建議配置5%的濃縮膠。通常建議分子量小于10KDa的，選擇15%的凝膠或Tricine-SDS-PAGE膠進(jìn)行跑膠，10-15KDa的選擇13.5%的膠，15-25KDa的選擇12%的膠。

為什么小分子蛋白要搭配高濃度凝膠？

1）SDS-PAGE電泳是根據(jù)蛋白分子本身的大小來分離的。分子量越小，在電場下遷移的速度越快。

2）高濃度凝膠中的丙烯酰胺鏈條更緊密，間隙更小，能更好地分離不同大小的蛋白分子。低濃度凝膠間隙較大，小分子蛋白很難分離開來。

3）高濃度的凝膠可以提供更高的電場強(qiáng)度。這對于快速移動的小分子蛋白來說，可以延長其在凝膠中的停留時間，更有利于分離和檢測。

4）高濃度凝膠的聚合度更高，也可以增加小分子蛋白在凝膠中的電泳時間，提供更好的分辨率。小分子蛋白所能結(jié)合的SDS較少，在蛋白向前遷移的過程中會向四周彌散，導(dǎo)致蛋白彌散。

5）還可以適當(dāng)增加濃縮膠占整塊膠的比例和濃縮膠的濃度，使蛋白樣品在濃縮膠中充分聚集、壓平，有利于蛋白的分離。

③ 電泳電壓

電泳電壓太大會導(dǎo)致跑在最前面的小分子蛋白成鋸齒狀，建議濃縮膠用80V 30分鐘，之后調(diào)成100V, 溴酚藍(lán)跑到距膠底1cm以上就停下，不要跑到底，否則目的蛋白可能跑出去了。

2）轉(zhuǎn)膜

① 膜的選擇

針對不同分子量的蛋白質(zhì)，PVDF 膜有兩種規(guī)格：0.45 μm 的膜適合檢測 MW ＞ 20 kDa 的蛋白質(zhì)，0.22μm 的膜適合檢測MW ＜ 20 kDa 的蛋白質(zhì)，而且0.22μm 的膜可以有效防止蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移過程中直接穿透過膜。

也有說0.22μm的膜大小分子通用，小分子不用擔(dān)心轉(zhuǎn)過，大分子不用刻意延長轉(zhuǎn)膜時間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，通常按常規(guī)250-300mA，1KDa/分鐘，都能轉(zhuǎn)上。

經(jīng)驗(yàn)分享：PVDF 膜使用之前需要在甲醇中浸泡 5min 后再轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中，這樣操作可以活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合。

② 轉(zhuǎn)膜方式

這里建議采用濕轉(zhuǎn)的方式進(jìn)行，轉(zhuǎn)膜液不用添加SDS，可以添加10-20%的甲醇。

為什么要添加甲醇？

1）增強(qiáng)凝膠的交聯(lián)度。高濃度凝膠的聚丙烯酰胺鏈會更緊密，孔隙更小，這有利于分離小分子蛋白。甲醇可以促進(jìn)聚丙烯酰胺之間的交聯(lián)，形成更緊密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2）減慢電泳速度。甲醇作為共溶劑，可以增加凝膠內(nèi)部的粘度，從而降低電泳時蛋白分子在凝膠內(nèi)的移動速度。這對于快速移動的小分子蛋白更有利于分離和檢測。

3）防止蛋白聚集。高濃度凝膠電泳時，小分子蛋白容易聚集在一起，影響分離效果。甲醇可以防止蛋白之間的非特異性相互作用，減少聚集。

4）提高蛋白轉(zhuǎn)移效率。甲醇可以增加轉(zhuǎn)膜時蛋白與PVDF膜間的親和力，有利于小分子蛋白從凝膠完全轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，提高檢測敏感性。

③ 轉(zhuǎn)膜電壓、電流、時間控制

對于小分子蛋白，還應(yīng)注意控制轉(zhuǎn)膜的電壓電流和時間。電流不宜太高，轉(zhuǎn)膜時間不能過長。具體分子力量對應(yīng)的轉(zhuǎn)膜條件可參考下圖。

3）抗體孵育

① 一抗稀釋比例的選擇

通?？贵w的說明書上都會給出一定的稀釋比例，對于分子量過小的蛋白來說，一抗應(yīng)選擇低一點(diǎn)的稀釋比例，這樣有助于抗體的結(jié)合。 

4）顯影

顯影時需要根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間，如果在暗處馬上可以看到條帶，建議曝光時間在30s-2min內(nèi)完成；如果信號較弱，第一遍滴加顯影液后條帶不會很清晰，可以把膜拿出來放一邊讓它反應(yīng)一會，然后再放回機(jī)器里面，重新滴加顯影液顯影，效果就會好不少；還可以嘗試適當(dāng)延長顯影時間，就能獲得清晰的條帶。 

5）案例分析

IL-8蛋白（interleukin-8 protein）是一種促炎性細(xì)胞因子，大小約為11kDa，通常由許多細(xì)胞產(chǎn)生，包括巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等。IL-8在免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移，并刺激這些細(xì)胞的激活。

經(jīng)驗(yàn)分享：上樣量較少，分離膠濃度過低，跑膠以及轉(zhuǎn)膜時間長等原因?qū)е履繕?biāo)位置沒有條帶，同時因?yàn)槠毓鈺r間過高出現(xiàn)較為嚴(yán)重的雜帶，背景也明顯變深。

6）常見問題&解析

① 如何確定樣本中靶標(biāo)蛋白的表達(dá)量

可以通過The Human Protein Atlas、GeneCards、BioGPS等數(shù)據(jù)庫查詢。很多小分子蛋白需要適當(dāng)刺激才能誘導(dǎo)表達(dá)，所以實(shí)驗(yàn)前盡量做好充分的文獻(xiàn)調(diào)研。

② 樣本制備小tips

在樣本制備過程中添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑，防止蛋白降解；在制樣過程中增加超聲處理，盡可能的充分裂解樣品，暴露抗原表位；以及盡量使用新鮮樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

③ 如何避免小分子蛋白由于彌散拖尾現(xiàn)象

最好還是保留3個以上marker，或者做全膜，避免蛋白被裁去。

7）相關(guān)文獻(xiàn)推薦

▲Tricine-SDS-PAGE是一種可用于分離極疏水蛋白質(zhì)以進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)組學(xué)工具，可用于分離1-100kDa之間的蛋白質(zhì)，是分離小于30 kDa蛋白質(zhì)的首選電泳系統(tǒng)。凝膠中使用的丙烯酰胺濃度低于其他電泳系統(tǒng)，這對疏水性蛋白質(zhì)尤為重要，因?yàn)榇蠖鄶?shù)小分子蛋白是疏水性的。

今天的文章就寫到這里啦！還有哪些做大/小分子量蛋白WB的經(jīng)驗(yàn)，也歡迎大家留言交流哦（如果認(rèn)同本篇內(nèi)容，麻煩點(diǎn)個贊鼓勵一下）！

參考文獻(xiàn)

https://mp.weixin.qq.com/s/ef-fpi4tscLxoxTC9EdE5A

https://mp.weixin.qq.com/s/qgsG9i6PoL0q_67Nz3Nkgw

https://mp.weixin.qq.com/s/hRSW2v1ML8hK5T0Oq8yecA

主營項(xiàng)目

1. 動物實(shí)驗(yàn)

動物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動生化檢測等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

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康旭禾生物提供包括動物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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