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細胞遷移和侵襲是生物學研究中常見的現(xiàn)象，也是疾病發(fā)展過程中重要的環(huán)節(jié)。

細胞遷移/侵襲實驗作為一種常用的生物醫(yī)學實驗，旨在評估細胞的侵襲和遷移能力，尤其是對細胞在模擬體內(nèi)的生理環(huán)境下的行為進行模擬和觀察，一般在腫瘤惡性化表型研究中最常見。因為在腫瘤治療中，普遍認為抑制腫瘤細胞遷移和侵襲是有效的治療手段。

因此在對腫瘤細胞進行干預(yù)（過表達、敲低、敲除、點突變、藥物處理）后對細胞的遷移與侵襲能力進行檢測，可以作為評估干預(yù)效果的一個有效指標。

No.1

細胞遷移/侵襲簡介

細胞遷移（Cell Migration）也稱為細胞爬行、細胞移動或細胞運動，是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動。細胞遷移為細胞頭部偽足的延伸、新的黏附建立、細胞體尾部收縮在時空上的交替過程。

細胞遷移是正常細胞的基本功能之一，是機體正常生長發(fā)育的生理過程，也是活細胞普遍存在的一種運動形式。在胚胎發(fā)育、血管生成、傷口愈合、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移等多個過程中都涉及到細胞遷移。由于轉(zhuǎn)移性疾病是導致癌癥死亡的關(guān)鍵因素，因此了解細胞遷移機制對于癌癥研究至關(guān)重要。

細胞侵襲（Cell Invasion）是細胞遷移的一種，與細胞遷移密不可分，是指細胞在原位突破基底膜，然后內(nèi)滲進入血管、淋巴管的過程，即入侵的細胞（如惡性腫瘤細胞）穿過胞外基質(zhì)層（Extracellular Matrix，ECM）或基底膜基質(zhì)層（BME）從一個區(qū)域侵入到另一個區(qū)域，在侵襲到新區(qū)域之前，ECM/BME被細胞內(nèi)的蛋白酶降解。

細胞侵襲常發(fā)生于傷口修復(fù)、血管形成和炎癥反應(yīng)以及組織的異常浸潤、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等過程中。因此，研究其中的機制對多種生理/病理過程都有著重要的意義。

而腫瘤細胞的侵襲性是腫瘤相關(guān)信號通路、藥物治療、靶向治療、致癌/抑癌基因等腫瘤學研究的一個重要指標。

檢測細胞遷移能力最常見的方法是細胞劃痕實驗和Transwell小室檢測，兩者的區(qū)別在于細胞劃痕簡單經(jīng)濟，模擬單層細胞在2D平面的遷移；而Transwell成本較高，模擬細胞在3D空間的遷移。另外，Transwell也是檢測細胞侵襲能力最常用的手段。

No.2

細胞劃痕實驗

細胞遷移：（cell migration）：是多細胞生物發(fā)育和存活關(guān)鍵的生物學過程，是細胞運動的表型之一。胚胎發(fā)育時器官的形成、傷口的愈合、免疫應(yīng)答等都需要細胞非常精準的遷移到特定部位。當有外部信號（化學、機械信號）刺激時，也會引起細胞發(fā)生遷移。

細胞遷移的機制：

①有的細胞有鞭毛或纖毛，通過鞭毛或纖毛擺動就能運動。

② 通過細胞的變形，帶動細胞的移動，如肌動蛋白 Actin 的聚合狀態(tài)發(fā)生改變帶動細胞變形。

③ 細胞膜流動：細胞運動時，細胞膜是循環(huán)流動的，外面的細胞膜與細胞內(nèi)的細胞膜庫發(fā)生交換，導致細胞遷移。

④ 細胞移動時還會涉及細胞核的重定位、高爾基體的重定向、微管組織中心的重定向。

細胞遷移的過程：

①細胞前端伸出片狀偽足；

②細胞前端偽足和細胞外基質(zhì)形成新的細胞黏附；

③細胞體收縮；

④細胞尾端和周圍基質(zhì)黏著解離，細胞向前運動。細胞遷移需要胞外、胞內(nèi)信號分子調(diào)控細胞骨架動力裝置所給予的驅(qū)動力與肌動蛋白細胞骨架介導的黏附所提供的錨定力之間的協(xié)調(diào)運作。

基本原理：

當細胞長到融合成單層狀態(tài)時，在融合的單層細胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕”，劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區(qū)域使“劃痕”愈合，在一定程度上模擬了體內(nèi)細胞遷移過程。

操作步驟：

培養(yǎng)板劃線—鋪板—細胞劃線—清洗—細胞培養(yǎng)觀察—結(jié)果分析

注意事項：

1、鋪板時一般選擇6孔板，因為6孔板大小適中，可保證有相當距離的平直劃痕，便于觀察。而且因為有5條定位線，與劃痕相交，這樣就有10個可固定監(jiān)測點，不作重復(fù)，誤差也很小。但是如果實驗需要高通量初篩，也可以用12或24孔板。

2、實驗時應(yīng)注意細胞生長狀況，選擇適當?shù)募毎臃N濃度。對不同類型細胞要觀察細胞貼壁率等，確定實驗時細胞種板數(shù)量和培養(yǎng)時間，保證培養(yǎng)終止時密度適當。

3、減少細胞增殖對實驗結(jié)果的影響，應(yīng)選擇加入無血清或血清濃度低（≤2%）的培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)。

細胞劃痕的優(yōu)點:

1、操作簡便，不需要借助特殊的實驗儀器；

2、實驗成本低。

細胞劃痕的缺點:

1、操作者劃痕易出現(xiàn)寬度不均一，影響劃痕愈合度評估；

2、劃痕會對周圍細胞造成機械損傷，影響細胞活性；

3、不太好排除增殖帶來的影響。

No.3

Transwell小室檢測

Transwell顧名思義是“穿孔實驗”，即將小室放入孔板中（常見的是24孔板），小室中含有密密麻麻的小孔，將細胞懸液加到小室中，小室放在加入完全培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)，細胞可通過形變穿過小室中的孔而跑到營養(yǎng)更豐富的小室外部并貼在外側(cè)。

通過對小室外部的細胞進行染色計數(shù)，就可以判斷細胞的遷移與侵襲能力的強弱。

基本原理：

細胞遷移與侵襲實驗就是將小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，上室內(nèi)添加上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)添加下層培養(yǎng)液。將細胞種在上室內(nèi)，由于膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。

圖2 Transwell實驗原理圖

應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的濾膜，可進行共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多方面研究。由于不同細胞的體積不同，選擇時需考慮到細胞大小。這里主要談幾種常用實驗：

1、共培養(yǎng)體系

細胞在濾膜孔徑小于3.0μm的條件下不會通過，因此，若研究不涉及細胞運動能力、不需細胞穿過濾膜時，則應(yīng)選擇3.0μm以下孔徑。將細胞A種于上室，細胞B種于下室，可研究細胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對細胞A的影響。

2、趨化性實驗

上室細胞可穿過濾膜進入下室，計數(shù)進入下室的細胞量則可反映下室成分對上室細胞的趨化能力，詳情如下：

（1）細胞B對細胞A的趨化作用：將細胞A種于上室，細胞B種于下室，研究細胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對細胞A的趨化作用；

（2）趨化因子對細胞的趨化作用：將細胞種于上室，下室加入某種趨化因子，研究該趨化因子對細胞的趨化作用。

3、腫瘤細胞遷移實驗

上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室遷移，計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。

4、腫瘤細胞侵襲實驗

與腫瘤細胞遷移實驗類似，但與腫瘤細胞遷移實驗不同的是，上室需鋪上一層基質(zhì)膠（常用人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel）以模仿體內(nèi)細胞外基質(zhì)（ECM），細胞欲進入下室，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的侵襲能力。

Transwell細胞遷移操作步驟：

細胞培養(yǎng)與處理—Transwell小室準備—制備細胞懸液—接種細胞至上方小室—細胞固定—細胞染色—封片—細胞觀察計數(shù)

注意事項：

1、選擇實驗細胞時需保證細胞狀態(tài)良好；

2、放入小室時，小心不要產(chǎn)生氣泡。如果有氣泡，請小心輕拍底板的側(cè)面以清除氣泡；

3、細胞固定時用棉簽擦去未遷移細胞時需要控制力度務(wù)必小心，不要戳破底部膜，更不要擦去已穿膜的細胞；

4、對于難穿膜的細胞可以進行饑餓處理后再進行相關(guān)實驗。

Transwell細胞侵襲操作步驟：

細胞培養(yǎng)與處理—包被基底膜—水化基底膜—制備細胞懸液—接種細胞至上方小室—細胞固定—細胞染色—封片—細胞觀察計數(shù)

No.4

注意事項或經(jīng)驗分享

1.直尺和馬克筆等工具用前務(wù)必照紫外消殺。

2.種板所用細胞數(shù)目可根據(jù)細胞的生長快慢調(diào)整接種數(shù)量。保證每組細胞鋪板密度一致，保證每孔務(wù)必鋪勻。

3.提前用馬克筆畫好線，避免細胞種板后不好操作。槍頭畫線之前，不要棄去原培養(yǎng)基，否則劃下來的細胞團塊會堆積在劃痕邊緣上堆積導致寬度不統(tǒng)一。

4.用槍頭畫線時，要用力均勻一致，垂直穩(wěn)定一氣呵成，避免寬度差別較大不利于結(jié)果分析的準確性。

5.根據(jù)交叉點定位拍照，避免了前后觀察時位置不固定的問題，結(jié)果更有說服力。

6.務(wù)必清洗干凈劃下來的活細胞，避免在拍照期間細胞貼壁在劃痕處并進行增殖影響結(jié)果。

7.0h拍照時可以在試驗記錄本上標記拍照位置，以便下各時間段拍攝同一位置。

8.拍照時注意不要露出馬克筆畫的線條，不要鏡頭過于模糊，盡量不要選擇邊緣的光影差別過大的位置，切換鏡頭時不要忘記換標尺，否則都會影響結(jié)果的自動分析。

9.根據(jù)細胞種類，選擇無血清或低血清培養(yǎng)基來降低細胞增殖的影響，或用絲裂霉素（1μg/ml）處理1h，抑制細胞的分裂，消除增殖的影響。但同時也會影響細胞遷移的速度。

10.一般拍照時間為0，2，4，6，8，10，12，16，24小時等選取，不建議超過24h，過度增殖造成實驗假陽性結(jié)果。

11.手工劃痕可能難以保證寬度一致性，culture Insert是現(xiàn)在市面上也推出的一種可以提前占據(jù)劃痕區(qū)域的模具，將細胞接種于Dish中間的Insert培養(yǎng)，細胞長滿Insert區(qū)域后用鑷子移除Insert產(chǎn)生筆直且無細胞損傷的劃痕。

12.分析結(jié)果中長度法，由于細胞遷移并不是齊頭并進的，可能組間差異大，建議用平均多條距離的值來代表。

主營項目

1. 動物實驗

動物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動生化檢測等

2. 細胞實驗

CCK8/MTT、原代細胞分離、流式細胞實驗、細胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學

PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等

4. 蛋白實驗

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實驗

HE染色、免疫組學、電鏡

6. 生理生化實驗

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標;動植物營養(yǎng)指標、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學實驗

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實驗

方案設(shè)計、整體實驗交付、標書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

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康旭禾生物提供包括動物實驗、細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關(guān)的各項服務(wù)。

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