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1、western blot 的優(yōu)點(diǎn)

答：靈敏，可達(dá)ng級(jí)，用Ecl顯色法理論上可達(dá)pg 級(jí)。方便，特異性高。

2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有目標(biāo)蛋白？

答：原因有很多：

a) 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；

b) 你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必須加入PMSF，抑制蛋白酶活性；

c) 你的抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說明，看是否有問題。

3、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？

答：a) 有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻]有變性完全，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(zhǎng)， 

      b) 也不排除你的抗原濃度過高，這時(shí)再加入適量上樣緩沖液即可。

4、我做的蛋白質(zhì)分子量很?。?0KD），請(qǐng)問怎么做WB？

答：可以選擇0.2μml的膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。

5、我的目的帶很弱，怎么加強(qiáng)？

答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低。

6、膠片背景很臟，有什么解決方法？

答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時(shí)間，提高牛奶濃度。

7、目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？

答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng)，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。

8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？

答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；

b) ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；

c) ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；

d) 二抗失活。

9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善.；

      b) 顯影時(shí)間過長(zhǎng)。

10、DAB好還是ECM好？

答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測(cè)pg 級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。

11、抗原檢測(cè)出的分子量比資料上的大，是怎么回事？

答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng)，可以打開二聚體。

      b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等。

12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么？

答：可能是：a)樣品濃度過低；

      b)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠。

13、磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等？

答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。

14、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎？

答：① 免疫組化可以用來進(jìn)行定位，但是不能精確定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量，但是不能定位。
      ② 兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會(huì)說明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

15、做Western Blot時(shí)，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？

答：懷疑是樣品問題，可能是：

1，樣品不能反復(fù)凍融；

2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗?jié)舛?。?duì)于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

16、細(xì)胞水平要做western blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot？

答：一般5×10^6就足夠了。

17、同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么？這樣對(duì)western blot有無影響？

答：能，沒有問題。

18、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎？

答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。

19、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？

答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時(shí)最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間，加20％甲醇。

21、想分離的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？

答：200kd的蛋白不好做， 分離膠用7％，積層膠 3.5％。

22、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？

答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。

23、蛋白變性后可以存放多久？

答：－80℃，一兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。

24、我所測(cè)定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？

答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?05KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。

25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成，是嗎？

答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼?，用ＢＳＡ代替?yīng)該好一點(diǎn)．

26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？

答：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。開始摸條件時(shí)，為了拿到陽性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。

27、做組織樣品的western的時(shí)候，怎樣處理樣品？

答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。

28、問大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？

答：做200kd蛋白的Western Blot時(shí)要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。

29、有什么方法可以提高上樣量？

答：a)可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量；

      b)用5倍的上樣緩沖液來稀釋變性

30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？

答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒有太大的關(guān)系， 盡量多上就行了， 但是不要超載。

31、一抗，二抗的比例是否重要？

答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。

32、要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

答：對(duì)二抗無要求，要看你實(shí)驗(yàn)條件來選擇，一般推薦用HRP標(biāo)記的二抗。

33、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？

答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。

34、Western Blot 中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？

答：抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。

35、在做Western Blot時(shí)，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。

36、檢測(cè)同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？

答：可以。

37、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？

答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢， 你延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分子一端就會(huì)好的多，但是小分子的就有可能會(huì)變淡。

38、做Western Blot時(shí)，同樣的抗體免疫組化能做出，而Western Blot卻不能？

答：這多半是抗體的問題，要看抗體的說明，是否能做Western Blot和免疫組化。

39、如果是6×8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？

答：一抗的稀釋度是有說明的，根據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為3－5ml。

40、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果。

答：無特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩次的緩沖液。

41、跑電泳的時(shí)候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對(duì)嗎？

答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時(shí)拿保鮮膜包起來，在里面加點(diǎn)水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。

42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？

答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE， 濕轉(zhuǎn)120mA， 45-60min就可以了， 可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。

43、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？

答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度），因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）。

44、我用的是可視marker，但是電泳總跑不全8條帶，請(qǐng)問什么原因？怎樣改善？膠用過8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買的。

答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時(shí)間試試看。當(dāng)然梯度膠也是不錯(cuò)的選擇。

45、是否Western Blot實(shí)驗(yàn)半定量一定要加ACTIN內(nèi)參？

答：對(duì)于發(fā)表文章的實(shí)驗(yàn)最好加內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)。46、核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？

答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。

47、做半定量Western Blot，內(nèi)參β-actin，GAPDH哪個(gè)好？

答：選用beta-actin就可以。

48、想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？

答：一般來說提取時(shí)加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)別。

49、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBST最后那個(gè)T是Tween嗎，濃度多大？

答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl：8g， Tris base：2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 調(diào)節(jié)pH 至 7.4, 加水定容至 1L。

50、封閉，一抗，二抗時(shí)的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如在室溫里做，或者要在4度下?

答：均可在室溫進(jìn)行，如果時(shí)間不夠，一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個(gè)小時(shí)，然后4度過夜。

51、請(qǐng)問一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？

答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì)較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。

52、怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道都能很直，上樣的量和灌膠是否很重要，電壓有什么要求？

答：影響跑膠跑的質(zhì)量，有以下幾個(gè)因素：

（1）電壓，小的電壓會(huì)使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠55v，分離膠75v就能跑得很好。

（2）膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時(shí)，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠.

53、為什么提高大分子量蛋白的轉(zhuǎn)移的時(shí)候，小分子量蛋白會(huì)丟失一些哪?什么原因?

答：小分子的蛋白在轉(zhuǎn)移過程中，會(huì)透過膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過去了。

  01  

Western Blot常見問題及處理

1．電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：●︶ 條帶呈笑臉狀原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好; 電泳系統(tǒng)溫度偏高?！瘭?條帶呈皺眉狀原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全?！裢衔苍颍簶悠啡芙獠缓??！窦y理（縱向條紋）

原因：樣品中含有不溶性顆粒?！駰l帶偏斜原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜?！駰l帶兩邊擴(kuò)散原因：加樣量過多。

2．Western blot結(jié)果中背景較高可能的原因及建議：
●膜封閉不夠
延長(zhǎng)封閉的時(shí)間；選擇更加適合的封閉液。
●一抗稀釋度不適宜
對(duì)抗體進(jìn)行滴度測(cè)試，選擇最適宜的抗體稀釋度。
●一抗孵育的溫度偏高
建議4℃結(jié)合過夜。
●選擇的膜容易產(chǎn)生高背景
一般硝酸纖維素膜的背景會(huì)比PVDF膜低。
●膜在實(shí)驗(yàn)過程中干過
實(shí)驗(yàn)過程中要注意保持膜的濕潤(rùn)。
●檢測(cè)時(shí)曝光時(shí)間過長(zhǎng)
減少曝光時(shí)間。

3．Western blot結(jié)果中雜帶較多可能的原因及建議：
●目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙?；稽c(diǎn)等），本身可以呈現(xiàn)多條帶。
查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小。
●目的蛋白有其它剪切本
查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性。
●樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解
加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作。
●上樣量過高，太敏感適當(dāng)減少上樣量。
●一抗特異性不高
重新選擇或制備高特異性的抗體。
●一抗不純
純化抗體
●一抗或者二抗?jié)舛绕?br/>降低抗體濃度。

4 . Western blot結(jié)果中無信號(hào)或顯示信號(hào)弱可能的原因及建議：
●檢測(cè)樣本不表達(dá)目的蛋白
選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽性對(duì)照，用于確定檢測(cè)樣本是否為陰性。
●檢測(cè)樣本低表達(dá)目的蛋白
提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。
●轉(zhuǎn)移不完全或過轉(zhuǎn)移
可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流。
●抗體不能識(shí)別測(cè)試種屬的相關(guān)蛋白
購(gòu)買抗體前應(yīng)當(dāng)認(rèn)真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識(shí)別測(cè)試種屬的對(duì)應(yīng)蛋白。
●一抗孵育時(shí)間不足
建議4℃結(jié)合過夜。
●二抗與一抗不匹配
選擇針對(duì)一抗來源的種屬的抗體。
●洗膜過度
洗膜時(shí)間不宜過長(zhǎng)，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。

5. 其它現(xiàn)象：

●膜上多處出現(xiàn)黑點(diǎn)或黑斑
原因：抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合。
●反白（條帶顯白色）
原因：目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕摺?br/>●蛋白分子量偏低或偏高
原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。

6．安全問題：

操作有毒試劑時(shí)，戴手套和口罩，且操作揮發(fā)性試劑應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。

  02  

IHC問題總結(jié)

Q1：邊緣效應(yīng)?

1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。

2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。

Q2：產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？

1） 抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。

2） 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。

3） 內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

4） 非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長(zhǎng)二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；

5）  DAB孵育時(shí)間過長(zhǎng)或濃度過高；

6） PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；

7）  標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。

Q3：免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些？

1）抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤。不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索最佳濃度。

2）抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合;建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)。

3）組織切片本身這種抗原含量低；

4）血清封閉時(shí)間過長(zhǎng)。

5）DAB孵育時(shí)間過短。

6）細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。

7）開始做免疫組化，一定要首先做個(gè)陽性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問題。

 Q4：背景強(qiáng)的原因?

1）考慮一抗?jié)舛雀撸?/p>

2）然后調(diào)整DAB孵育時(shí)間；

3）也要考慮血清封閉時(shí)間是否過短

4）適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長(zhǎng)浸洗時(shí)間等。

Q5：石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？

1）烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長(zhǎng)烤片時(shí)間和提高烤片溫度

2）用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購(gòu)買到或這自己做

3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織，

4）用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。

Q6：一抗從4度拿出后，為什么要進(jìn)行37度復(fù)溫？

1） 一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；

2） 另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用，4度和37度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同，前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

Q7：切片染色后背景太深，如何區(qū)分特異性與非特異性著色？全片著色是指整個(gè)切片全都染上了顏色，著色的強(qiáng)度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：

1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡(jiǎn)單的按說明書進(jìn)行染色。

2）抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。

3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)，因?yàn)樵跊]有酶的情況下，過氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過長(zhǎng)。

4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（大于24小時(shí)）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4oC冰箱過夜，對(duì)結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(huì)出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時(shí)間太長(zhǎng)。

6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時(shí)最好設(shè)立陽性對(duì)照和用使用過的抗體作比較。

Q8：脫片產(chǎn)生的原因有哪些？

1）多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。

2）組織切的不好，切片機(jī)的問題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。

3）沒烤好，時(shí)間短，溫度不夠之類。

4）操作的時(shí)候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。

5）修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過長(zhǎng)了，或者放進(jìn)100度的修復(fù)液時(shí)手法不好，咚的一聲就丟進(jìn)去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時(shí)候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。

6）一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹(jǐn)慎，用PBS的時(shí)候盡量用泡的，不要沖?；旧习堰@些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。7）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。

Q9：DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？

1）切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。

2）有可能是你 顯色液底物加到片子上后沒有搖勻，造成局部底物濃度不一致，所以加完顯色液后最好將片子來回左右晃動(dòng)幾下，使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。

3）如果你的片子是中間的染色深，靠近邊上的淺，那有可能是你蠟圈畫的太小，顯色液覆蓋的面積不過大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。最外側(cè)的組織片最好離顯色液外緣0.5 cm。

Q10：染色過強(qiáng)1）抗體的濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體）；

2）孵育溫度過高；

3）DAB顯色時(shí)間過長(zhǎng)或DAB濃度過高，顯色時(shí)間不能超過5-10分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)。

Q11：非特異性背景染色

1）操作過程中沖洗不充分；

2）組織中含過氧化物酶未阻斷 ，可再配置新鮮3%H2O2封閉，孵育時(shí)間延長(zhǎng)；

3）組織中含內(nèi)源性生物素，可用正常非免疫動(dòng)物血清再封閉；

4）血清蛋白封閉不充分，可延長(zhǎng)血清蛋白封閉時(shí)間。

Q12：染色弱

1）抗體濃度過低，孵育時(shí)間過短，可提高抗體濃度，孵育時(shí)間不能少于60分鐘；

2）試劑超過有效使用期 及時(shí)更換試劑；

3）操作中，滴加試劑時(shí)緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋，可每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥）；

4）室溫太低，低于15℃ 若室溫低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分鐘（或4℃冰箱過夜）；

5）蛋白封閉過度，封閉時(shí)間不要超過10分鐘。

 Q13：染色陰性

1）操作步驟錯(cuò)誤 重新試驗(yàn)，設(shè)立陽性對(duì)照；

2）組織中無抗原 設(shè)立陽性對(duì)照片，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

3）一抗與二抗種屬連接錯(cuò)誤 仔細(xì)確定一抗與二抗種屬無誤。

主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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