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程序性細(xì)胞死亡(Programmed Cell Death, PCD)，是指細(xì)胞接受某種信號(hào)或受到某些因素刺激后，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種主動(dòng)性消亡過程。凋亡、自噬、細(xì)胞程序性壞死、細(xì)胞焦亡都是是程序性死亡的表現(xiàn)形式。
細(xì)胞焦亡是一種最新發(fā)現(xiàn)的炎癥細(xì)胞程序性死亡方式，主要通過炎癥小體介導(dǎo)包含Caspase-1在內(nèi)的多種Caspase的激活，造成包括GSDMD在內(nèi)的多種Gasdermin家族成員發(fā)生剪切和多聚化，造成細(xì)胞穿孔，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡。相比于細(xì)胞凋亡（apoptosis），細(xì)胞焦亡發(fā)生的更快，并會(huì)伴隨著大量促炎癥因子的釋放。細(xì)胞焦亡在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生化特征以及基因水平上都與凋亡、自噬、鐵死亡、壞死等傳統(tǒng)的細(xì)胞死亡方式具有顯著的差異，目前有數(shù)種檢測細(xì)胞焦亡的方法，這篇文章將給各位概述目前常用的研究手段。

01

形態(tài)學(xué)變化

1. 倒置顯微鏡

從顯微鏡下觀察細(xì)胞焦亡時(shí)，可看到典型的膜泡狀結(jié)構(gòu)（bubbles on the plasma membrane），這是由于細(xì)胞膜被穿孔，由于細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差異，細(xì)胞發(fā)生腫脹引起。從分子機(jī)制上來說，細(xì)胞焦亡的發(fā)生依賴于gasdermin（GSDMs）家族蛋白在細(xì)胞膜上打孔。打孔完成后，成熟的IL-1β和IL-18，還有其它的細(xì)胞內(nèi)容物DAMPs，如 ATP, HMGB1, S100 proteins, and IL-1a 釋放出去，有別于細(xì)胞凋亡的炎癥過程產(chǎn)生。

2. 掃描電鏡如圖1所示，可以清楚看到在細(xì)胞質(zhì)膜破裂前，焦亡的細(xì)胞形成大量小泡，即焦亡小體。之后細(xì)胞膜上會(huì)形成孔隙，細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物流出。

圖1. Sham大鼠和急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡細(xì)胞電鏡圖(×7000). A: Sham組大鼠正常的腺泡細(xì)胞, 細(xì)胞核完整, 細(xì)胞膜無破裂. B: 急性胰腺炎組大鼠焦亡的腺泡細(xì)胞, 胞內(nèi)容物外溢, 細(xì)胞膜破裂, 細(xì)胞核固縮.

02

檢測焦亡相關(guān)蛋白

細(xì)胞焦亡的生化特征主要標(biāo)志有炎癥小體的形成，caspase和gasdermin的激活以及大量促炎癥因子的釋放。

1. q-PCR/Western Blot方法檢測焦亡相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)水平Western Blot：                                                                                                                                                     （1）Gasdermin D細(xì)胞焦亡發(fā)生時(shí)，Gasdermin D（GSDMD，53KD）被切割，產(chǎn)生30KD左右的片段，可以購買GSDMD一抗，用Western blot（WB）來驗(yàn)證。                               （2）Caspase-1、Caspase-4細(xì)胞焦亡發(fā)生時(shí)，caspase-1和caspase-4被激活，可以通過檢測caspase-1和caspase-4的活性來驗(yàn)證。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                     圖2. 檢測 H37Rv 和 H37RvΔEST12 感染巨噬細(xì)胞 caspase-1 和 GSDMD 活性，H37Rv?EST12 組與 H37Rv 組在感染后 1 小時(shí)內(nèi)無明顯變化。在刺激 6h 后，H37Rv 在 BMDMs 中誘導(dǎo)了更多裂解的 caspase-1 p20 和 GSDMD-N 末端片段（圖 G）。在 BMDMs 中，與 BCG 相比 BCG-EST12 持續(xù)誘導(dǎo)更多的 caspase-1 p20 和 GSDMD-N 末端片段（圖 J）。

2. ELISA檢測IL-1β、IL-18等炎癥因子的水平

炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18在細(xì)胞焦亡中經(jīng)歷caspase-1依賴性激活和分泌。白介素-1β是一種有效的內(nèi)源性熱原，可刺激發(fā)熱、白細(xì)胞組織遷移和多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。白細(xì)胞介素-18誘導(dǎo)干擾素γ的產(chǎn)生，對活化T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它細(xì)胞類型很重要。白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-18在一系列炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。

ELISA 檢測 IL-1β分泌

03

TUNEL染色

DNA隨機(jī)降解，不像細(xì)胞凋亡時(shí)，DNA降解為180-200bp及其整數(shù)倍的片段。染色體DNA斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。

細(xì)胞TUNEL染色

04

細(xì)胞活性檢測

1. CCK-8/MTT檢測

2. 乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測NK細(xì)胞活性

乳酸脫氫酶(LDH)是活細(xì)胞胞漿內(nèi)含酶之一。在正常情況下，不能透過細(xì)胞膜。當(dāng)靶細(xì)胞受到效應(yīng)細(xì)胞的攻擊而損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性改變，LDH可釋放至介質(zhì)中，釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶I(NAD+)變成還原型輔酶I (NADH2），后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化氮唑藍(lán)(INT)或硝基氯化四氮唑藍(lán)(NBT)形成有色的甲簪類化合物，在490nm或570nm波長處有一高吸收峰，利用讀取的OD值，經(jīng)過計(jì)算即可得NK細(xì)胞活性。1．靶細(xì)胞制備　
取培養(yǎng)24～48h的靶細(xì)胞，洗滌3次，最后用完全RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105／ml，備用。2．效應(yīng)細(xì)胞的制備　
常規(guī)方法分離PBMC或小鼠脾細(xì)胞，洗滌3次，最后用完全RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107／ml。3．效-靶細(xì)胞作用
將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各0.1ml(E/T＝100∶1)加入40孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中，每份標(biāo)本設(shè)3復(fù)孔，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放對照組和最大釋放對照組(0.1ml靶細(xì)胞＋0.1ml 1％NP-40液)，低速離心1000r／min，2min后，置37℃、5％CO2溫箱中孵育2h。4．酶促反應(yīng)　
取出培養(yǎng)物，吸取各孔上清0.1ml加于另一培養(yǎng)板孔中，置37℃預(yù)溫10min，每孔加入新鮮配制的LDH底物溶液0.1ml，室溫避光反應(yīng)10～15min，每孔加入1mol/L檸檬酸終止液30μl，以終止酶促反應(yīng)。5．結(jié)果計(jì)算　
用酶聯(lián)檢測儀在570nm波長下讀取各孔OD值，并計(jì)算NK細(xì)胞活性。

LDH 釋放實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞毒性

05

總結(jié)

近幾年細(xì)胞焦亡的持續(xù)火爆，細(xì)胞焦亡國自然中標(biāo)項(xiàng)目數(shù)量逐年增加，尤其近兩年呈直線上升趨勢。PubMed中大于5分的相關(guān)研究文章超過2000篇；同時(shí)，從近幾年命中的國自然項(xiàng)目中，我們也可以發(fā)現(xiàn)，在多種疾病或研究領(lǐng)域均有細(xì)胞焦亡的相關(guān)研究即將受到國自然基金委的資助。

主營項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

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