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WB實(shí)驗(yàn)，是一種常用的蛋白分析技術(shù)。實(shí)驗(yàn)中每一步的把握，將會(huì)直接影響結(jié)果的顯現(xiàn)。本文將給大家展示W(wǎng)B實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)操作步驟。跟小編一起來(lái)看看吧~

蛋白樣品的提取及蛋白含量的檢測(cè)

蛋白樣品的好壞，直接決定了能否做出來(lái)蛋白條帶，所以蛋白樣品的提取需嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

凝膠配置

凝膠選擇：請(qǐng)根據(jù)蛋白分子量的大小，選擇合適濃度的分離膠，可參考凝膠配置試劑盒中的說(shuō)明書(shū)，或者參考文獻(xiàn)。配膠的APS需要在4° 的冰箱中保存。注意，配膠的時(shí)候，膠一定一定要混勻。配膠的試劑中，APS與TEMED是促凝劑，所以在加促凝劑之前，需先把其他組分混勻。

操作：將配置好的分離膠沿著玻璃板一側(cè)緩慢打入玻璃板中，這個(gè)時(shí)候不用擔(dān)心打入氣泡。灌入合適量的分離膠之后，加入適當(dāng)劑量的ddWater或者無(wú)水乙醇封膠。（加入封膠試劑量沒(méi)有規(guī)定，蓋住整個(gè)分離膠膠面即可）

上樣

Marker孔加入5-10μL，其余蛋白總上樣量30-50μg.

電泳

接上電源后，先用80V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑到濃縮膠與分離膠交界處，成線狀，改為恒壓120v直至溴酚藍(lán)電泳到凝膠底部，此過(guò)程約用時(shí)1.5h。

小貼士：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求可以進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，蛋白條帶較大時(shí)，可延長(zhǎng)電泳時(shí)間；條帶較小時(shí)，參照預(yù)染Marker條帶決定電泳時(shí)間。電泳開(kāi)始的時(shí)候，開(kāi)制冰機(jī)制冰，為后面的轉(zhuǎn)膜做準(zhǔn)備。

轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)）

操作步驟

1. 取出凝膠，根據(jù)Marker切下目的條帶，用蒸餾水沖洗，并裁剪與SDS-PAGE凝膠相同大小的PVDF膜，濾紙應(yīng)與纖維墊相同大小；

2.PVDF膜用甲醇浸泡1min后，和濾紙一同浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中；

3. 按照黑色板-纖維墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-纖維墊-白色板依次放好，夾緊板后放入濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)槽內(nèi)，黑色板的一面對(duì)黑色負(fù)極；

4.在轉(zhuǎn)膜槽中加滿電轉(zhuǎn)液，開(kāi)始轉(zhuǎn)膜。（轉(zhuǎn)膜槽置于水中，并放入冰凍結(jié)塊的冰袋，盡量多放幾個(gè)冰袋，保證電轉(zhuǎn)一直處于低溫下進(jìn)行。若轉(zhuǎn)膜時(shí)間較長(zhǎng)，中途溫度升高，可更換冰袋）

小貼士：蛋白大小大于140kD條件下，先在電流200mA情況下轉(zhuǎn)膜120min，然后將電流提高到250mA，繼續(xù)轉(zhuǎn)膜30min。

封閉和抗體的孵育

漂洗

PVDF膜置于回旋振蕩器上漂洗1min，重復(fù)漂洗2-3次。

封閉

用含5% 脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2h。磷酸化蛋白用5%的BSA封閉2h。

一抗孵育

用含5%脫脂奶粉的TBST（檢測(cè)磷酸化蛋白用含5% BSA的TBST）稀釋相應(yīng)的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過(guò)夜。

洗滌

TBST充分洗滌PVDF膜3次，15min/次。

二抗孵育

用稀釋一抗體系相同的稀釋液稀釋HRP標(biāo)記二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫孵育1h。

洗滌

TBST充分洗滌PVDF膜4次，15min/次。

顯色曝光

ECL發(fā)光液A液與B液1：1混合（現(xiàn)配現(xiàn)用）；

PVDF膜從TBST洗液中取出后，用濾紙吸干水分（一般用干凈鑷子夾住PVDF膜，讓膜的一角接觸濾紙）；

將PVDF放置于成像儀上，均勻滴加ECL工作液，排出氣泡，開(kāi)始曝光。

小貼士：先選擇自動(dòng)曝光進(jìn)行曝光。同一張膜上未曝光出條帶的，可選擇手動(dòng)曝光，加長(zhǎng)時(shí)間再次曝光。

如有需要，請(qǐng)聯(lián)系我們~

主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書(shū)寫(xiě)作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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