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原理

 蛋白質(zhì)印跡法 (WB) 是一種廣泛使用的基于抗體的技術(shù)，借助抗體與目的蛋白（抗原）的特異性結(jié)合，檢測(cè)細(xì)胞或組織提取物中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

 實(shí)驗(yàn)流程圖

小編將詳細(xì)介紹蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)的步驟，并提供結(jié)果分析的指導(dǎo)，助大家更好的完成實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)步驟

01

樣品制備

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)的第一步是樣品制備。通常，您可以從細(xì)胞培養(yǎng)物、動(dòng)物組織或微生物培養(yǎng)物等樣品中收集蛋白質(zhì)。在此過程中，您需要避免蛋白質(zhì)的降解和失活。

以下是一般的樣品制備步驟：

a. 收集細(xì)胞或組織：使用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌細(xì)胞或組織，以去除雜質(zhì)和外部污染物。

b. 細(xì)胞破碎：加入蛋白提取緩沖液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），破壞細(xì)胞膜和核膜，釋放蛋白質(zhì)。

c. 離心：將細(xì)胞裂解液或組織裂解液進(jìn)行離心，去除細(xì)胞碎片和核酸等雜質(zhì)。

d. 收集上清液：將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，以去除未溶解的固體。

02

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

在進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)前，您需要確定蛋白質(zhì)的濃度，以便加載相同的蛋白質(zhì)量進(jìn)行電泳分離。有幾種方法可用于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，如BCA法或Bradford法。

a. BCA法（雙硫鍵還原法）：首先，準(zhǔn)備一系列蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用BCA試劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)，生成可測(cè)定光密度的復(fù)合物。

b. Bradford法：該方法使用考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，該試劑與蛋白質(zhì)結(jié)合形成深藍(lán)色物質(zhì)，測(cè)量其吸光度。

03

SDS-PAGE電泳

SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）是一種將蛋白質(zhì)按照分子量大小進(jìn)行分離的常見方法。以下是簡(jiǎn)要的步驟：

a. 準(zhǔn)備凝膠：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的聚丙烯酰胺凝膠濃度和孔隙度。通常使用10%至15%的凝膠。

b. 配制電泳緩沖液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)操作程序制備Tris-緩沖溶液，加入適量的SDS和硫酸銨，調(diào)整pH值。將電泳緩沖液加入電泳槽中。

c. 加載樣品：將樣品蛋白質(zhì)與加載緩沖液混合，加熱至95°C，使之變性。然后，將樣品加載到凝膠孔中。

d. 電泳：將凝膠浸入電泳槽中，將電泳槽兩端連接到電源，施加適當(dāng)?shù)碾妷菏沟鞍踪|(zhì)沿凝膠電泳。

e. 停止電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動(dòng)到合適位置或接近凝膠底部時(shí)，停止電泳。

f. 凝膠染色：使用染色劑（如Coomassie藍(lán)染液）對(duì)凝膠進(jìn)行染色，以顯示蛋白質(zhì)帶狀。

g. 存儲(chǔ)凝膠：將凝膠轉(zhuǎn)移到顯影儀或圖像記錄系統(tǒng)中，記錄凝膠圖像以備后續(xù)分析使用。

04

轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)膜是將凝膠上的蛋白質(zhì)遷移到膜上的一個(gè)步驟，以便進(jìn)行抗體的探針檢測(cè)。常用的膜材料有聚偏氟乙烯（PVDF）和硝酸纖維素（NC）。以下是轉(zhuǎn)膜步驟：

a. 準(zhǔn)備膜：切割適當(dāng)大小的膜，并將其在轉(zhuǎn)膜緩沖液中濕潤。

b. 電泳后處理：取出凝膠，將其在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡一段時(shí)間

c. 轉(zhuǎn)膜裝置組裝：將濕潤的膜放在轉(zhuǎn)膜裝置上，層疊在凝膠上。確保膜與凝膠之間沒有氣泡。

d. 轉(zhuǎn)膜操作：將轉(zhuǎn)膜裝置組裝到轉(zhuǎn)膜槽中，添加足夠的轉(zhuǎn)膜緩沖液，使其覆蓋整個(gè)膜和凝膠。連接上正負(fù)電極，施加適當(dāng)?shù)碾妷?，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作。

e. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)完全轉(zhuǎn)移到膜上后，停止轉(zhuǎn)膜操作。取出膜并進(jìn)行后續(xù)的處理。

05

封閉

在進(jìn)行抗體結(jié)合之前，需要對(duì)膜進(jìn)行封閉，以避免非特異性結(jié)合和減少背景信號(hào)。一般會(huì)使用牛血清白蛋白（BSA）或脫脂奶粉作為封閉劑。以下是阻斷步驟：

a. 準(zhǔn)備封閉緩沖液：在TBST緩沖液中加入適量的封閉劑（通常為5%脫脂奶粉或1% BSA）。

b. 封閉操作：將膜放入封閉緩沖液中，輕輕搖晃，使其完全接觸。

c. 封閉時(shí)間：通常封閉操作需要1-2小時(shí)，室溫進(jìn)行。

06

抗體孵育

抗體孵育是關(guān)鍵步驟之一，用于特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白。以下是抗體孵育步驟：

a. 準(zhǔn)備一抗：選擇與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的一抗。

b. 稀釋抗體：根據(jù)供應(yīng)商提供的建議或先前的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，將抗體稀釋到適當(dāng)濃度的封閉緩沖液中。

c. 抗體孵育：將膜放入含有稀釋抗體的封閉緩沖液中，使其與目標(biāo)蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合。孵育溫度和時(shí)間根據(jù)抗體的要求進(jìn)行設(shè)定。

d. 洗滌：在抗體孵育后，將膜放入封閉緩沖液中進(jìn)行洗滌，去除非特異性結(jié)合的抗體。

07

二抗結(jié)合及探針檢測(cè)

在經(jīng)過一抗結(jié)合后，通常需要使用與一抗相對(duì)應(yīng)的二抗進(jìn)行結(jié)合，該二抗與一個(gè)酶、熒光染料或放射性標(biāo)記結(jié)合，以提供可檢測(cè)的信號(hào)。

a. 選擇二抗：根據(jù)一抗的物種來源，選擇相應(yīng)的二抗。

b. 稀釋二抗：根據(jù)供應(yīng)商提供的建議或先前的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，將二抗稀釋到適當(dāng)濃度的TBST緩沖液中。

c. 二抗結(jié)合：將膜放入含有稀釋二抗的TBST緩沖液中，使其與一抗進(jìn)行結(jié)合。

d. 探針檢測(cè)：根據(jù)二抗的標(biāo)記物，選擇合適的方法進(jìn)行探針檢測(cè)。例如，可以使用酶底物進(jìn)行著色、熒光探針進(jìn)行熒光檢測(cè)，或者用放射性探針進(jìn)行放射性測(cè)量。

08

圖像獲取及分析

使用分析系統(tǒng)（如顯影儀、熒光成像儀或放射性顯像系）獲取膜上的圖像，并進(jìn)行后續(xù)的分析。以下是常見的圖像分析步驟：

a. 圖像獲?。簩⒛し湃胂鄳?yīng)的圖像獲取系統(tǒng)中，進(jìn)行圖像記錄。

b. 圖像分析：使用圖像處理軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，測(cè)量蛋白質(zhì)帶的密度和大小。

c. 定量分析：通過與適當(dāng)?shù)膬?nèi)部參考蛋白或總蛋白的相對(duì)定量比較，確定目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

結(jié)果分析

1.信號(hào)強(qiáng)度：根據(jù)圖像分析的結(jié)果，觀察目標(biāo)蛋白帶在膜上的信號(hào)強(qiáng)度。較強(qiáng)的信號(hào)表示高蛋白質(zhì)表達(dá)，較弱的信號(hào)可能表示低蛋白質(zhì)表達(dá)。

2.分子量大?。和ㄟ^與分子量標(biāo)記品對(duì)比，在凝膠上的目標(biāo)蛋白帶遷移位置來估計(jì)其分子量大小。

3.特異性：確保只有目標(biāo)蛋白帶出現(xiàn)信號(hào)，而其他非特異性結(jié)合的蛋白不產(chǎn)生信號(hào)。檢查其他帶狀信號(hào)是否與預(yù)期的目標(biāo)蛋白大小和形態(tài)相符。

4.負(fù)對(duì)照和陽性對(duì)照：分析實(shí)驗(yàn)中的負(fù)對(duì)照和陽性對(duì)照結(jié)果，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的有效性和可靠性。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法（如t檢驗(yàn)或方差分析）對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定差異的顯著性。

     需要注意的是，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)是一種復(fù)雜的技術(shù)，結(jié)果分析需要綜合考慮實(shí)驗(yàn)中的多個(gè)因素，并結(jié)合之前的研究背景和目的進(jìn)行解讀，對(duì)于結(jié)果的進(jìn)一步分析和解釋，可能需要借助其他實(shí)驗(yàn)或技術(shù)的支持。

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主營項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

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