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細(xì)胞增殖是生物體的重要生命特征，指細(xì)胞在周期調(diào)控因子的作用下，通過DNA復(fù)制等反應(yīng)，完成細(xì)胞分裂的過程。增殖檢測一般是分析分裂中細(xì)胞的數(shù)量變化，進(jìn)而反映細(xì)胞的生長狀態(tài)及活性，目前廣泛應(yīng)用于腫瘤生物學(xué)，分子生物學(xué)，藥代動(dòng)力學(xué)等領(lǐng)域。

細(xì)胞增殖檢測的方法眾多，應(yīng)用非常廣泛，按檢測原理主要分為4 類：檢測DNA合成、檢測代謝活性、檢測細(xì)胞增殖相關(guān)抗原和檢測ATP濃度。其中，細(xì)胞DNA合成檢測是通過測定細(xì)胞的DNA合成量來評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力，直接測定DNA合成是檢測細(xì)胞增殖最準(zhǔn)確的方法，它是測定物質(zhì)毒性、評(píng)估藥物安全評(píng)價(jià)、判斷細(xì)胞健康、細(xì)胞增殖等研究方向常用方法之一，常用的檢測試劑主要是EdU、BrdU等。

實(shí)驗(yàn)原理

EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）與BrdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，它們能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復(fù)制的DNA分子，然后分別利用免疫熒光技術(shù)、與Apollo熒光染料特異性反應(yīng)檢測細(xì)胞增殖情況。

傳統(tǒng)的BrdU有一大缺點(diǎn)，就是需要變性DNA后才能與抗體結(jié)合，但這就破壞了DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，影響了其他染料的結(jié)合染色，導(dǎo)致染色彌散，準(zhǔn)確性降低等問題。而EdU檢測法更簡單、更快速、更準(zhǔn)確，不需要嚴(yán)苛的樣品變性(酸解、熱解、酶解)處理，有效地避免了樣品損傷，有助于在組織、器官的整體水平上觀測細(xì)胞增殖的真實(shí)情況，具有更高的靈敏度和更快的檢測速度。這是一種新型的非放射性同位素細(xì)胞增殖檢測的方法，在細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)體組織及臨床研究中得到了廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)可用于細(xì)胞成像、流式、細(xì)胞示蹤、DNA損傷修復(fù)檢測、線粒體活性檢測以及病毒增殖活性檢測等。

實(shí)驗(yàn)步驟

細(xì)胞培養(yǎng)

收集細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液以2.5×10^5個(gè)/孔接種于提前置有爬片的12孔板中，過夜培養(yǎng)。

藥物處理

按照不同分組處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

EdU標(biāo)記

用10 mM EdU溶液在無血清培養(yǎng)基中制備2 X EdU工作溶液，將2 X EdU溶液添加到等體積的培養(yǎng)基中，37 ℃孵育2 h。

細(xì)胞固定

去除培養(yǎng)基，加入0.5 mL 4%多聚甲醛固定液，室溫固定15 min。

通透

去除固定液，PBS洗3次，加入0.5 mL 0.3% Triton X-100通透劑，室溫孵育15 min。

Click反應(yīng)

去除通透劑，PBS洗3次，配制Click Additive Solution，每孔加入200 μL反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min。

封片

去除反應(yīng)液，PBS洗3次，加入含DAPI的抗熒光衰減封片劑，室溫孵育10 min。

拍照

注意事項(xiàng)

1. 加入含有Edu的培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)基的用量以沒過細(xì)胞為適宜。

2. 根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類不同，確定細(xì)胞生長周期，再進(jìn)一步確定Edu培養(yǎng)基的培養(yǎng)時(shí)間，大多數(shù)細(xì)胞為2小時(shí)培育時(shí)間。

3. 細(xì)胞類型、培養(yǎng)液種類、細(xì)胞密度、細(xì)胞增殖速度等多方面的因素會(huì)影響EdU摻入到細(xì)胞中的量，因此初次使用時(shí)建議對(duì)EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索。

4. 染色完成后，最好立即進(jìn)行觀察。如若條件限制，請(qǐng)4℃避光保存，保存時(shí)間不宜過長，不超過3天。

5. Click Additive配制成溶液后請(qǐng)注意適當(dāng)分裝。如果溶解后有白色物質(zhì)析出，可上下顛倒多次，待全部溶解后使用。