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做基礎(chǔ)研究的小伙伴有沒有覺得實驗思路好設(shè)計，但是如何篩選關(guān)鍵基因是個難題。今天看一篇，文章在篩選基因方面也做了大量分析，小伙伴們學(xué)會了，接著再做一篇基礎(chǔ)研究，又是一篇sci到手。

1. 文獻簡介

Caveolin-1 identified as a key mediator of acute lung injuryusing bioinformatics and functional research

發(fā)表年份：2022

影響因子：9

期刊名稱：Cell Death & Disease

2. 研究背景

急性肺損傷(Acute Lung Injury, ALI)是一種嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，通常繼發(fā)于全身炎癥反應(yīng)。發(fā)病突然、發(fā)展迅速、預(yù)后差。然而，ALI的病理是復(fù)雜的，尚未完全闡明。通過生物信息學(xué)的分析可能有助于探索ALI的潛在機制，并有助于確定未來臨床研究中使用的新靶點。本研究采用生物信息學(xué)方法分析了在線臨床5個數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)CAV-1和NF-κBp65的差異表達在ALI中很重要。此外，進一步在體內(nèi)和體外驗證了CAV-1和NF-κBp65的作用，同時也探索了CAV-1為ALI治療提供新靶點的潛在機制。

3. 主要結(jié)果

 1. RCC原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位的scRNA景觀圖

為了研究RCC腫瘤的細胞異質(zhì)性，對6例患者的原發(fā)腫瘤和其中2例患者的LN（淋巴結(jié)）轉(zhuǎn)移進行了scRNA-seq譜分析(圖1A, B；表1和表2)。隨后進行質(zhì)控，從6名患者中獲得46,552個細胞進行scRNA-seq分析?；谌旧w區(qū)域間的平均表達，計算每個細胞的全染色體推斷拷貝數(shù)變異(CNVs)。以非惡性細胞為參照，CNVs呈現(xiàn)惡性細胞間的異常特征(圖1C)，區(qū)分出30,514個惡性細胞和14,762個非惡性細胞。CNV基因表示為基于GO BP的基因集網(wǎng)絡(luò)（圖1D）。原發(fā)(malignant-pri)和轉(zhuǎn)移(malignant-LN)惡性細胞的CNV評分均顯著高于非惡性細胞(圖1E)。惡性細胞的上皮細胞評分明顯高于非惡性細胞 (圖1F)。根據(jù)CNVs和上皮標記分析，大多數(shù)細胞是具有一致的惡性或非惡性分類的簇的一部分。

2.RCC的TME表征

14,762個非惡性細胞被聚類成7種主要的細胞類型(圖2A)，包括T細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、B/漿細胞、NK細胞和成纖維細胞。T細胞和成纖維細胞亞群進一步以更高的分辨率聚集。如圖2B所示，主要T細胞群分為CD8+ T細胞，CD4+ T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞。540個成纖維細胞被重新聚集成兩個亞組(圖2C)。與非惡性細胞相比，基于單片UMAP算法的腫瘤異質(zhì)性，共聚集了30,514個惡性細胞(圖2D)。各惡性細胞簇表達前10位的標志物如圖2E所示。

3. 惡性腫瘤細胞表達模式的異質(zhì)性和轉(zhuǎn)移程序的鑒定

接下來，研究了腫瘤亞群中異質(zhì)性惡性細胞的表達模式是如何變化的。使用NNMF算法揭示惡性細胞集群傾向共表達的一致的基因集。確定了4個基因組在惡性細胞集群4的細胞中存在差異(圖3A)。對6個惡性腫瘤集群中的每一個使用這種方法，確定了至少一個惡性腫瘤集群中單個細胞之間一致變化的總共60個特征基因。然后，應(yīng)用分層聚類將60個特征基因提取為代表多個惡性亞群中不同共表達模式的元特征(圖3B)。

在至少兩個亞群的惡性細胞中有六種表達模式。如圖3B所示，兩個程序(簇1和2)主要由細胞角蛋白和EPCAM等上皮基因組成。另外一個程序反映了細胞周期的G1/S和G2/M期，并區(qū)分了每個惡性亞群中不同周期的細胞。最后一種程序富集了缺氧相關(guān)基因(圖3B)。

 4. SERPINE2在轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用

作者檢查了所有RCC樣本中參與轉(zhuǎn)移- II程序的基因的表達。這些注釋基因在所有RCC組織中表達，包括原發(fā)和轉(zhuǎn)移樣本，并且在至少兩個樣本中是top基因(圖3C)在scRNA譜中檢測了惡性和非惡性細胞之間的DEGs，發(fā)現(xiàn)了37個共同表達的基因，其中排名最高的基因位于NNMF程序中(圖3D)。作者檢查了TCGA生存數(shù)據(jù)中的所有常見基因以過濾出致癌基因(圖3E)。過濾后，發(fā)現(xiàn)高表達的SERPINE2與較差的總生存期(OS)相關(guān)(圖3E)。所有惡性scRNA亞群均表達SERPINE2，其中惡性1-3表達量更高(圖3F)。此外，原發(fā)惡性細胞中SERPINE2表達最高(圖3G)。GSEA和GSAV均表明，在SERPINE2含量高的惡性細胞中，細胞增殖、細胞運動和遷移途徑顯著富集。

接下來，作者比較了SERPINE2在RCC細胞系和正常腎上皮細胞系HK-2中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他RCC細胞系相比，Caki-1表達的SERPINE2最高。了解到Caki-1起源于人類RCC轉(zhuǎn)移腫瘤部位，作者通過Hi-C、ATAC-seq，結(jié)合Caki-1與HK-2之間的RNA-seq，探討了染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和表觀遺傳因素是否參與了SERPINE2的基因和功能調(diào)控。SERPINE2位點的室狀態(tài)為B(正常細胞系)至A (RCC細胞系)，該位點在ATAC-seq上呈開放狀態(tài)，表明SERPINE2位點具有活躍的相互作用頻率(圖3H)。RNA-seq結(jié)果還顯示，與HK-2相比，SERPINE2在Caki-1中高表達。此外，SERPINE2區(qū)域的TAD在HK-2和Caki-1之間存在差異，表明在Caki-1細胞中，隨著新的TAD邊界的產(chǎn)生，TAD的大小減小(圖3I)。這些數(shù)據(jù)表明SERPINE2不僅在轉(zhuǎn)錄組水平上起作用，而且與RCC的基因組變化相關(guān)。因此，基于全基因組學(xué)和scRNA-seq, SERPINE2可能在RCC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮潛在作用。

5.SERPINE2在RCC和藥物反應(yīng)中作為轉(zhuǎn)移相關(guān)癌基因

SERPINE2促進腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制尚不清楚。作者根據(jù)SERPINE2的平均表達來評估TCGA患者的體細胞改變(高組，n = 164;低組，n = 168)。前人研究的RCC基因變化如圖4A所示。SERPINE2高、低組MTOR、MUC16、NOTCH2和LPR1存在差異(圖4A)。然后作者在TCGA兩組間進行GSEA比較。EMT通路顯著富集 (圖4B)。與未發(fā)生轉(zhuǎn)移的原發(fā)腫瘤組織(n = 199)相比，LN或其他轉(zhuǎn)移患者的組織(n = 89)中SERPINE2的表達水平較高(圖4C)。此外，轉(zhuǎn)移患者中SERPINE2的表達也顯著高于GSE105261隊列正常組織(圖4D)。在GSE53757隊列中，SERPINE2在腫瘤中的表達明顯高于正常組織(圖4E)。接下來，基于最大的公開藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫cgp2016預(yù)測TCGA樣本的藥物反應(yīng)。SERPINE2高組對舒尼替尼的IC50應(yīng)答率較高，與SERPINE2低組相比應(yīng)答率較低 (圖4F)。Estimate算法可以計算出大樣本的免疫浸潤水平。作者發(fā)現(xiàn)SERPINE2高組的免疫浸潤高于低組 (圖4G)。因此，SERPINE2的表達也可能與免疫治療有關(guān)。作者在scRNA-seq中檢測MTOR的表達。SERPINE2高表達組MTOR表達增加 (圖4H)。最終耗竭CD8+ T細胞的特征基因(PDCD1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、TOX、ENTPD1、BATF和PRDM1)整合在圖4I中，提示終末耗竭的CD8+ T細胞實際上影響了免疫浸潤。在接受nivolumab治療的Checkmate025隊列中，較高的SERPINE2表達與較差的生存率相關(guān) (圖4J)。這些數(shù)據(jù)提示SERPINE2可能是RCC中的一個惡性基因并參與藥物反應(yīng)。

6.SERPINE2促進體外和體內(nèi)ccRCC侵襲，并伴有上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT）

為了研究SERPINE2是否促進了RCC腫瘤的惡性生物學(xué)行為和轉(zhuǎn)移，作者通過qRT-PCR驗證了SERPINE2在RCC中的功能。結(jié)果顯示，SERPINE2在Caki-1細胞中高表達，在786-O細胞中低表達。然后構(gòu)建SERPINE2過表達細胞(786-O)和SERPINE2敲低細胞(Caki-1)，并通過qPCR和Western blot觀察(圖5G)。通過集落形成和CCK-8細胞增殖實驗、Transwell細胞遷移和侵襲實驗檢測SERPINE2表達對RCC細胞增殖和侵襲的影響。結(jié)果顯示，sh-SERPINE2組RCC細胞遷移和侵襲明顯減少(圖5A, B)，OE-SERPINE2組顯著升高(圖5C, D)。sh-SERPINE2組細胞存活率顯著降低(圖5E)，OE-SERPINE2組細胞存活率顯著升高(圖5F)。此外，將786-O-OE-SERPINE2或786-O-NC-SERPINE2細胞注射到裸鼠尾靜脈中，標記穩(wěn)定熒光素酶。記錄8周內(nèi)的光子通量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，786-O-OE-SERPINE2組小鼠的肺轉(zhuǎn)移較對照組小鼠更為嚴重 (圖5G)。肺組織HE結(jié)果如圖5H所示。碳酸酐酶9 (CA9)和SERPINE2在786-O-OE-SERPINE2誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移部位高表達(圖5H)。

7. 在的臨床隊列中，SERPINE2與低生存率相關(guān)，并預(yù)測RCC轉(zhuǎn)移

作者驗證了兩個隊列(TMA30, n = 29;TMA2020, n = 289)。H-score定量分析(圖6A)顯示，SERPINE2在腫瘤組織組中的表達高于腫瘤旁組織組(圖6B)。根據(jù)臨床信息對隊列進行分類，發(fā)現(xiàn)SERPINE2在有轉(zhuǎn)移的組織以及基于IHC評分的Fuhrman分級(圖6D)或腫瘤分期 (圖6E)較高的組織中表達明顯較高(圖6C)。根據(jù)使用TMA30的5年OS對SERPINE2進行ROC分析得出的最佳截斷值，將患者分為高表達組和低表達組。H-score的臨界值為202.5,AUC為0.8342(圖6F)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，SERPINE2-高亞組患者的OS較差(圖6G)和無進展生存期(PFS) (圖6H)。然后，對臨床信息和SERPINE2進行nomogram分析(圖6I)，發(fā)現(xiàn)SERPINE2表達是ccRCC患者OS的獨立危險因素。

4. 結(jié)論

總之，本研究表明惡性細胞和TME的不同表達模式在RCC的進展中起著不同的作用。SERPINE2被認為是抑制晚期RCC轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點。這篇文章通過單細胞+多組學(xué)研究篩選了關(guān)鍵的基因SERPINE2并進行了后續(xù)驗證，雖然驗證實驗不是很多，但是文章依然可以發(fā)到9分，所以想發(fā)高分并不是只有實驗一條路可以走，這篇文章的思路小伙伴可以學(xué)起來！

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