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細(xì)胞培養(yǎng)是指將細(xì)胞從動(dòng)物或植物體內(nèi)取出，然后在適宜的人工環(huán)境中生長(zhǎng)的過(guò)程。細(xì)胞可以在培養(yǎng)前直接從組織中取出并通過(guò)酶或機(jī)械方法進(jìn)行解離，也可以來(lái)源于已建立的細(xì)胞系或細(xì)胞株。

細(xì)胞培養(yǎng)又具體分為細(xì)胞傳代、換液、凍存、復(fù)蘇等一系列過(guò)程，每個(gè)步驟都對(duì)應(yīng)著不同的操作技術(shù)要點(diǎn)，想要養(yǎng)好細(xì)胞，每一步都必須掌握。

1. 細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇是指將休眠的細(xì)胞重新活化，使之重新生長(zhǎng)，分裂產(chǎn)生子細(xì)胞的過(guò)程。復(fù)蘇后的細(xì)胞可重新進(jìn)入細(xì)胞周期，獲得細(xì)胞類型特異的生物學(xué)功能。復(fù)蘇細(xì)胞一般采用快速融化法，以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，避免慢速融化產(chǎn)生的水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。

操作步驟：

1. 從液氮中取出凍存的細(xì)胞，迅速將凍存管放入37℃水浴快速融解。

2. 在生物安全柜或超凈臺(tái)中，將解凍后的細(xì)胞懸液緩慢加入5mL預(yù)溫的細(xì)胞培養(yǎng)基（推薦產(chǎn)品：埃澤思人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基 AC-1001003）。

3. 1200rpm 離心3min，吸掉上清，加入10mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

4. 將細(xì)胞均勻鋪到培養(yǎng)皿中，水平十字振動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻分布，5% CO2的 37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后觀察細(xì)胞狀態(tài)。

5. 24h后更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天更換培養(yǎng)液。

注意細(xì)節(jié)：

1. 從液氮罐中拿出凍存管時(shí)要做好防護(hù)工作，需配備防凍手套和護(hù)目鏡；

2. 水浴鍋溫度：嚴(yán)格控制在37℃，且解凍時(shí)凍存管管口切勿浸沒(méi)到水中；

3. 復(fù)蘇接種密度：一管細(xì)胞（1×106個(gè)）接種到1個(gè)T25（底面積25cm2）中，搖勻后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2. 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)中的細(xì)胞傳代培養(yǎng)，當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止另一方面也會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長(zhǎng)或發(fā)生中毒。此時(shí)就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿(瓶)內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個(gè)過(guò)程就稱為傳代或者再培養(yǎng)。對(duì)單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。

操作步驟：

1. 在顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到 90%，即可傳代。

2. 在超凈臺(tái)/安全柜中，吸掉原有培養(yǎng)基，加入PBS 溶液清洗一次，加入細(xì)胞消化液（

推薦產(chǎn)品：埃澤思細(xì)胞消化液 AC-1001024）使之完全覆蓋皿/瓶底。

3. 室溫孵育4-5分鐘或37℃孵育2-4分鐘，顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞脫離皿底即停止消化。

4. 加入消化液2倍體積的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打瓶壁上未完全脫離的細(xì)胞，并輕輕吹打混勻，使細(xì)胞完全分散。

5. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，1200rpm離心3min。

6. 棄上清，加入人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。1:3-1:4比例傳代，或按1-2x

104cells/c㎡傳代，均勻鋪在培養(yǎng)皿/瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注意細(xì)節(jié)：

1. 細(xì)胞傳代所需的時(shí)間:2-4天。5代及之前的細(xì)胞，生長(zhǎng)速度較快。5 代以后的細(xì)胞，生長(zhǎng)速度稍緩；

2. 消化時(shí)間需要同時(shí)考慮到細(xì)胞本身特性，細(xì)胞密度，胰酶濃度等多方面因素，靈活調(diào)整，切忌生搬硬套；

3. 傳代過(guò)程中加入任何試劑都應(yīng)該輕柔緩慢的加到皿壁，切忌直接加到細(xì)胞面上，如果細(xì)胞本身貼壁能力較差，可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

3. 細(xì)胞凍存

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。除此之外，還可以利用細(xì)胞凍存的形式來(lái)購(gòu)買、寄贈(zèng)、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞。

操作步驟：

1. 細(xì)胞達(dá)到90%匯合度，吸掉原有培養(yǎng)基，PBS清洗一次。

2. 加入細(xì)胞消化液使之完全覆蓋皿/瓶底，室溫孵育4-5min或37℃孵育2-4min分鐘，顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞脫離皿底即停止消化。

3. 加入消化液2倍體積的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液槍輕輕吹打瓶壁上未完全脫離的細(xì)胞，并輕輕吹打混勻，使細(xì)胞完全分散。

4. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，1200rpm離心3min，吸掉上清。

5. 加入適量無(wú)血清細(xì)胞凍存液（推薦產(chǎn)品：埃澤思無(wú)血清細(xì)胞凍存液（治療級(jí)） AC-1001006），調(diào)整細(xì)胞凍存密度在1×106cells/mL左右，每支凍存管分裝1.5-2ml。

6. 直接放入-80℃，24h后轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期保存。

注意細(xì)節(jié)：

1. 細(xì)胞如果是第一次養(yǎng)，建議至少凍存兩個(gè)批次以上，以盡量避免因?yàn)閮龃鎲?wèn)題導(dǎo)致細(xì)胞絕種；

2. 如果沒(méi)有程序降溫盒，可以將凍存細(xì)胞依次放于4℃1h，-20℃2h，-80℃過(guò)夜，大部分細(xì)胞也可以適應(yīng)，但原代細(xì)胞不建議這么處理。

主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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