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近期，一項(xiàng)發(fā)表于《Frontiers in Immunology》的研究成果，為肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）的治療帶來了新的希望。該研究由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院的Haishui Zheng團(tuán)隊(duì)完成，題為“A disulfidptosis-related lncRNA signature for analyzing tumor microenvironment and clinical prognosis in hepatocellular carcinoma”，揭示了二硫鍵死亡（disulfidptosis）相關(guān)長非編碼RNA（lncRNA）在HCC中的預(yù)后價值及潛在治療機(jī)制。

No.1研究背景

肝細(xì)胞癌（HCC）是全球第六大常見癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。其早期癥狀不明顯，且存在諸多風(fēng)險(xiǎn)因素，導(dǎo)致臨床治療面臨巨大挑戰(zhàn)。盡管近年來靶向治療和免疫治療取得了進(jìn)展，但HCC患者仍面臨高復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和藥物耐受性問題。因此，探索HCC的分子機(jī)制并開發(fā)創(chuàng)新療法至關(guān)重要。

細(xì)胞死亡在多細(xì)胞生物的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，其失調(diào)可導(dǎo)致癌癥等疾病。除了經(jīng)典的凋亡途徑外，越來越多的研究表明，非凋亡細(xì)胞死亡形式也以受調(diào)控的方式發(fā)生，如壞死、鐵死亡等。最近，Gan等人提出了一種新的細(xì)胞死亡形式——二硫鍵死亡（disulfidptosis），為癌癥治療開辟了新途徑。二硫鍵死亡由癌細(xì)胞內(nèi)二硫化物分子的顯著積累引發(fā)，尤其在高表達(dá)SLC7A11的癌細(xì)胞中，這種積累會導(dǎo)致肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白之間的異常二硫鍵結(jié)合，破壞其組織結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

長非編碼RNA（lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA分子，它們在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA后轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白質(zhì)翻譯。此外，lncRNA在免疫學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、炎癥反應(yīng)和癌癥中也扮演著關(guān)鍵角色。在HCC中，lncRNA與細(xì)胞死亡過程的調(diào)控密切相關(guān)，例如lncRNA DUXAP8通過與SLC7A11相互作用降低HCC對索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡的敏感性。因此，識別調(diào)控HCC中二硫鍵死亡的精確lncRNA及其機(jī)制，對于HCC的治療具有重要意義。

No.2研究方法與結(jié)果

1.數(shù)據(jù)獲取與分析

研究人員從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）數(shù)據(jù)庫中獲取了374個HCC樣本和50個相鄰正常肝臟樣本的RNA測序數(shù)據(jù)和臨床信息。這些數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理，以每千堿基轉(zhuǎn)錄本每百萬映射讀數(shù)（FPKM）的形式呈現(xiàn)。研究人員首先通過Pearson相關(guān)性分析，篩選出與10個二硫鍵死亡相關(guān)基因（DRGs）共表達(dá)的lncRNA（DCLs），設(shè)定的篩選標(biāo)準(zhǔn)為相關(guān)系數(shù) \(R > 0.3\) 且 \(P < 0.001\)。這一過程識別出863個DCLs。同時，利用R包“Limma”進(jìn)行差異表達(dá)分析，識別出在HCC和正常組織之間差異表達(dá)的lncRNA（DELs），設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)為對數(shù)2倍變化絕對值大于1且 \(P < 0.001\)，共識別出3261個DELs。將DCLs和DELs進(jìn)行整合，最終得到494個既差異表達(dá)又與DRGs共表達(dá)的lncRNA（DCDELs）。

2.構(gòu)建與驗(yàn)證預(yù)后標(biāo)志物

研究人員進(jìn)一步對這494個DCDELs進(jìn)行單變量Cox回歸分析，以評估它們對HCC患者總生存期（OS）的預(yù)后能力，篩選出23個預(yù)后相關(guān)的DCDELs。隨后，利用LASSO回歸分析和多變量Cox回歸分析，從這23個預(yù)后相關(guān)的DCDELs中篩選出5個lncRNA（FOXD2-AS1、SLC25A30-AS1、TMCC1-AS1、LINC01063和AC009283.1），構(gòu)建了一個二硫鍵死亡相關(guān)的預(yù)后標(biāo)志物?；谶@些lncRNA的風(fēng)險(xiǎn)評分，將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，結(jié)果顯示高風(fēng)險(xiǎn)組患者的總生存期（OS）顯著短于低風(fēng)險(xiǎn)組。這一結(jié)果通過Kaplan-Meier生存分析得到了驗(yàn)證，高風(fēng)險(xiǎn)組的生存曲線明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖2）。

研究人員還通過主成分分析（PCA）和t分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE）分析，驗(yàn)證了該預(yù)后標(biāo)志物在區(qū)分高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者方面的有效性。PCA分析顯示，訓(xùn)練隊(duì)列、測試隊(duì)列和全部隊(duì)列中的兩個風(fēng)險(xiǎn)亞組均能被有效區(qū)分（圖4）。此外，該預(yù)后標(biāo)志物在預(yù)測生存方面表現(xiàn)出良好的性能，時間依賴性接收者操作特征（ROC）曲線分析顯示，該標(biāo)志物在1年、3年和5年的預(yù)測準(zhǔn)確性分別為0.782、0.735和0.734（圖4）。

3.實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

研究人員在細(xì)胞和患者水平上進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，成功誘導(dǎo)了HCC細(xì)胞中的二硫鍵死亡表型。他們首先通過RT-qPCR驗(yàn)證了5個lncRNA在HCC細(xì)胞系和組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)這些lncRNA在HCC組織中的表達(dá)水平高于正常組織（圖5A-K）。此外，通過葡萄糖剝奪處理HCC細(xì)胞系，觀察到細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞收縮、肌動蛋白絲積累和細(xì)胞體積減小，證實(shí)了二硫鍵死亡現(xiàn)象。研究人員還通過免疫熒光顯微鏡觀察到，經(jīng)過葡萄糖剝奪處理的HCC細(xì)胞中，F(xiàn)-肌動蛋白染色顯示出更明顯的肌動蛋白絲聚集和細(xì)胞形態(tài)變化（圖6）。

研究人員進(jìn)一步探索了二硫鍵死亡相關(guān)基因在HCC中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因在HCC組織中的表達(dá)水平高于正常組織。此外，他們還通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了二硫鍵死亡現(xiàn)象在HCC中的存在，并發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞死亡現(xiàn)象與SLC7A11基因的表達(dá)水平直接相關(guān)。通過添加二硫化物還原劑TCEP，研究人員觀察到細(xì)胞死亡得到了顯著緩解，這進(jìn)一步證實(shí)了二硫鍵死亡現(xiàn)象的存在（圖6F-G）。

研究人員還對兩個lncRNA（FOXD2-AS1和LINC01063）進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)它們在HCC細(xì)胞中的表達(dá)水平較高，并且它們的敲低能夠增加HCC細(xì)胞對二硫鍵死亡的敏感性。通過RT-qPCR驗(yàn)證了這兩個lncRNA的敲低效率，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)水平在敲低后顯著降低（圖7A-D）。此外，通過細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)和F-肌動蛋白染色，研究人員觀察到敲低這兩個lncRNA后，HCC細(xì)胞在葡萄糖剝奪條件下的活性顯著降低，并且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了更明顯的變化（圖7B-F）。

No.3研究意義與展望

本研究通過構(gòu)建基于二硫鍵死亡相關(guān)lncRNA的預(yù)后標(biāo)志物，為HCC的預(yù)后評估和治療提供了新的視角。該標(biāo)志物不僅能夠有效預(yù)測患者的生存期，還與腫瘤微環(huán)境（TME）和腫瘤突變負(fù)荷（TMB）存在潛在關(guān)聯(lián)。此外，該標(biāo)志物在預(yù)測化療藥物敏感性和免疫治療效果方面的潛在價值，為HCC的個體化治療提供了新的思路。

然而，該研究也存在一些局限性。首先，研究依賴于公共數(shù)據(jù)庫中的回顧性患者信息，缺乏外部數(shù)據(jù)庫的驗(yàn)證。其次，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證部分樣本量較小，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。此外，對于二硫鍵死亡相關(guān)lncRNA在HCC中的具體調(diào)控機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入研究。

總之，這項(xiàng)研究為HCC的診斷和治療提供了新的靶點(diǎn)和思路，有望推動HCC治療領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。未來，隨著更多研究的深入，基于二硫鍵死亡的HCC治療策略有望從實(shí)驗(yàn)室走向臨床，為患者帶來更大的福音。

主營項(xiàng)目

1. 動物實(shí)驗(yàn)

動物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動生化檢測等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3 分子生物學(xué)

PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

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