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論文信息：

標(biāo)題：A prospective study of neoadjuvant pembrolizumab plus chemotherapy for resectable esophagealsquamous cell carcinoma: The Keystone-001 trial

期刊：Cancer Cell

影響因子：48.8

作者：Xiaobin Shang, Yongjie Xie, Jinpu Yu3, Jun Yu, yujun, Jihui Hao, Haojihui, Hongjing Jiang

發(fā)表日期：2024年10月

doi: 10.1016/j.ccell.2024.09.008

關(guān)鍵詞：食管鱗狀細(xì)胞癌; 免疫檢查點(diǎn)抑制劑; 單細(xì)胞RNA測(cè)序; T細(xì)胞受體γ鏈恒定區(qū)2, 新輔助治療

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)總覽

01

研究隊(duì)列

入組標(biāo)準(zhǔn)：

?組織學(xué)確診為可切除（II-III期）食管鱗癌（ESCC）

? PD-L1 CPS ≥1（部分亞組分析要求）

?未接受過(guò)系統(tǒng)性抗腫瘤治療

02

治療方案與手術(shù)

(1)新輔助階段：

帕博利珠單抗（200mg IV，Q3W） + 化療（紫杉醇 175mg/m2 + 順鉑 75mg/m2），共3周期。

(2)手術(shù)階段：

新輔助治療后4-6周行機(jī)器人輔助食管癌根治術(shù)（Ivor Lewis術(shù)式）。

(3)術(shù)后治療：

實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)帕博利珠單抗輔助治療（≤1年）。

03

療效評(píng)估指標(biāo)

結(jié)果

01

Figure1 

圖1. Keystone-001研究的臨床結(jié)局分析

(A) 患者流程圖（Patient flow diagram）描述患者篩選、入組、排除及最終分析隊(duì)列的流程。

(B) 泳道圖（Swimmer plots）意向治療人群（ITT，Intention-To-Treat population，n = 47）中每位患者的治療時(shí)間線：新輔助治療階段（帕博利珠單抗聯(lián)合化療的用藥周期與持續(xù)時(shí)間）,輔助治療階段（術(shù)后帕博利珠單抗維持治療）,病理學(xué)結(jié)果（如主要病理緩解MPR、腫瘤殘留比例）和隨訪狀態(tài)（復(fù)發(fā)、死亡或生存）。(C) 總生存期（OS）的Kaplan-Meier曲線（Kaplan-Meier curves of Overall Survival）展示接受帕博利珠單抗（Pembrolizumab）聯(lián)合化療新輔助治療并后續(xù)手術(shù)患者的總生存期（從入組至任何原因死亡的時(shí)間）。(D) 無(wú)病生存期（DFS）的Kaplan-Meier曲線（Kaplan-Meier curves of Disease-Free Survival）。

02

圖2. 探索與對(duì)新輔助治療的差異反應(yīng)相關(guān)的特征性細(xì)胞亞群變化

(A)單細(xì)胞測(cè)序分析的工作流程圖。(B)氣泡圖顯示了從提交給分析以進(jìn)行分析的樣本中獲得的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的聚類分析。(C)-t分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE）圖顯示細(xì)胞聚類分析，使用Seurat的t-SNE算法對(duì)所有樣本進(jìn)行注釋可視化。（D-G）t-SNE圖顯示了基于外周血來(lái)源(D)、腫瘤來(lái)源(E)、患者來(lái)源(F)和治療反應(yīng)(G)的細(xì)胞亞群。(H)條形圖顯示每個(gè)患者的每個(gè)細(xì)胞亞組按治療反應(yīng)所占的比例。(I)外周血和腫瘤組織中TRGC2+ NKT細(xì)胞的比例。箱形圖分別顯示了良好反應(yīng)組和不良反應(yīng)組在腫瘤組織和外周血中TRGC2+ NKT中的細(xì)胞比例。(J)有利反應(yīng)組和不良反應(yīng)組分別在治療前后顯示總NKT和TRGC2+ NKT的細(xì)胞比例的箱形圖。

03

圖3.外周血TRGC2+ NKT細(xì)胞群與對(duì)新輔助治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)。

(A)條形圖顯示了基于治療反應(yīng)的每個(gè)患者的細(xì)胞群比例。(B)顯示所有NKT細(xì)胞群中差異表達(dá)基因的熱圖。(C)氣泡圖顯示了TRGC2+ NKT細(xì)胞中的KEGG分析。(D)火山圖顯示了標(biāo)記不同NKT細(xì)胞亞群差異的功能基因。從左到右分別是：TRGC2+ NKT細(xì)胞、IL7R+ CCR4+ NKT細(xì)胞、CD69+ NKT細(xì)胞、CCL4+ IFNG+ NKT細(xì)胞、CXCR4+ NKT細(xì)胞和PDCD1+ TIGIT+ NKT細(xì)胞。(E)顯示不同NKT細(xì)胞亞群的偽時(shí)間軌跡的軌跡圖。(F)曼哈頓圖顯示關(guān)鍵基因TRGC2、RRM2、IL7R、TK1、FGFBP2和NKG7的表達(dá)軌跡，紅色表示TRGC2+ NKT細(xì)胞群。(G)全面的偽時(shí)間軌跡熱圖和通路富集圖，顯示了NKT細(xì)胞群中TRGC2+ NKT細(xì)胞群的特征功能、關(guān)鍵基因軌跡、通路富集分析和分化狀態(tài)。

04

圖4.外周血和腫瘤組織中TRGC2+ NKT細(xì)胞亞組

(A)-分布隨機(jī)鄰包埋（(A)-SNE）圖。(B) t-SNE圖比較了兩組患者在腫瘤組織中TRGC2+ NKTs的分布密度和比例的變化，并通過(guò)t-SNE圖進(jìn)行可視化。(C)火山圖分別顯示了腫瘤組織和外周血中TRGC2+ NKT在有利組和不利組之間的差異表達(dá)基因，以及TRGC2+ NKT在外周血和腫瘤組織之間的差異表達(dá)基因。(D)熱圖說(shuō)明綜合聚類分析結(jié)果顯示組間基因表達(dá)特征。功能通路富集分析揭示了涉及差異表達(dá)基因的信號(hào)通路。(F)箱形圖顯示了三個(gè)不同的功能TRGC2+ NKT細(xì)胞組在有利反應(yīng)組和不利反應(yīng)組之間的比例。(G)條形圖顯示了腫瘤內(nèi)三個(gè)細(xì)胞亞組在有利反應(yīng)組和不良反應(yīng)組之間的基因集評(píng)分的分布。(H)顯示外周血中幼稚TRGC2+ NKT細(xì)胞亞群的時(shí)間分化軌跡的軌跡圖。(I)系統(tǒng)發(fā)育樹顯示了TRGC2+ NKT細(xì)胞亞群從外周血到腫瘤組織的進(jìn)化軌跡。(J)曼哈頓圖顯示了在不同TRGC2+ NKT細(xì)胞亞群的進(jìn)化軌跡上顯著改變的基因。(K)基因表達(dá)趨勢(shì)圖，顯示TRGC2+ NKT細(xì)胞亞群從外周血到腫瘤組織的分子表達(dá)趨勢(shì)。

05

圖5.TRGC2+NKT細(xì)胞在食管鱗狀細(xì)胞癌免疫治療反應(yīng)中作用的其他驗(yàn)證

(A) 工作流程示例說(shuō)明了從4個(gè)不同患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中分離出的TRGC2+ NKT細(xì)胞。(C)細(xì)胞凋亡定量，數(shù)據(jù)顯示為直方圖。(D)方案從4例患者的PBMCs中分離TRGC2+和TRGC2- NKT細(xì)胞，然后分別與患者來(lái)源的類器官進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。（E和F）類器官caspase 3中細(xì)胞凋亡的定量熒光檢測(cè)；如圖所示的類器官來(lái)自4個(gè)。

PART 03

核心發(fā)現(xiàn)

本研究為一項(xiàng)前瞻性II期臨床試驗(yàn)，納入47例局部晚期可切除食管鱗癌（ESCC）患者，采用 術(shù)前帕博利珠單抗（PD-1抑制劑）聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)化療序貫達(dá)芬奇機(jī)器人根治術(shù) 的創(chuàng)新策略。結(jié)果顯示：①安全性卓越：新輔助治療期間無(wú)≥3級(jí)免疫相關(guān)不良事件及手術(shù)延期，驗(yàn)證方案耐受性。②病理緩解突破：46例完成治療患者中，主要病理緩解率（MPR）達(dá)72%（33/46），完全緩解率（pCR）為41%（19/46），顯著高于歷史新輔助化療數(shù)據(jù)（MPR約20%-30%）。③生存獲益顯著：中位隨訪27.2個(gè)月后，2年總生存率（OS）與無(wú)病生存率（DFS）分別升至91%和89%，刷新局部晚期ESCC生存紀(jì)錄。④機(jī)制深度解析：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序聯(lián)合多隊(duì)列驗(yàn)證揭示 外周血TRGC2+ NKT細(xì)胞擴(kuò)增 為療效預(yù)測(cè)關(guān)鍵標(biāo)志物（AUC=0.86）；類器官共培養(yǎng)證實(shí)該亞群通過(guò) IFN-γ/TNF-α雙信號(hào)軸 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；跨癌種分析提示其免疫激活表型具廣譜抗腫瘤潛力。

PART 04

創(chuàng)新點(diǎn)

本研究在食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）治療領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了以下創(chuàng)新性突破：

1. 治療策略革新  

率先將PD-1抑制劑（帕博利珠單抗）聯(lián)合化療應(yīng)用于III期可切除ESCC的新輔助治療，填補(bǔ)了該治療方案在早中期患者群體中的循證空白。通過(guò)中位27.2個(gè)月的長(zhǎng)期隨訪證實(shí)，其2年總生存率（91%）與無(wú)病生存率（89%）顯著優(yōu)于歷史化療數(shù)據(jù)，為優(yōu)化臨床實(shí)踐提供了證據(jù)。

2. 全程管理理念創(chuàng)新

突破傳統(tǒng)療效評(píng)價(jià)框架，首次整合病理緩解率（MPR）、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)評(píng)估與生活質(zhì)量評(píng)分等多維度指標(biāo)，揭示新輔助治療通過(guò)改善機(jī)體免疫營(yíng)養(yǎng)微環(huán)境提升治療耐受性，形成"療效-生存質(zhì)量"雙獲益模式。

3. 生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)  

運(yùn)用單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)在國(guó)際上首次報(bào)道：外周血TRGC2+ NKT細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化與治療應(yīng)答顯著相關(guān)。通過(guò)類器官共培養(yǎng)模型及空間轉(zhuǎn)錄組分析，闡明該亞群通過(guò)IFN-γ/TNF-α軸激活抗腫瘤免疫循環(huán)的作用機(jī)制，為液體活檢指導(dǎo)精準(zhǔn)治療奠定理論基礎(chǔ)。

3. 研究方法學(xué)創(chuàng)新

①創(chuàng)建"臨床隊(duì)列-單細(xì)胞測(cè)序-功能驗(yàn)證"三位一體研究范式。

②縱向采集治療前后配對(duì)外周血與組織樣本構(gòu)建單細(xì)胞圖譜。

③結(jié)合TCR克隆追蹤與細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)解析免疫重塑規(guī)律。  

該研究實(shí)現(xiàn)了從臨床現(xiàn)象到分子機(jī)制的閉環(huán)驗(yàn)證，推動(dòng)ESCC治療進(jìn)入免疫動(dòng)態(tài)監(jiān)控時(shí)代。

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主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

聯(lián)系我們

康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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