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CCK-8是一種在細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用的試劑，用于檢測細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性。它可以直接添加到細(xì)胞樣品中，無需預(yù)先配制各種成分。細(xì)胞增殖越快，顏色越深，表明毒性較小；而細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對于相同的細(xì)胞類型，顏色的深淺（即生成的formazan的量）與細(xì)胞數(shù)量呈線性關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)材料及試劑：

細(xì)胞

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板

CO2培養(yǎng)箱

酒精燈

微量移液器

酶標(biāo)儀

CCK-8試劑盒等

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，制備成一定濃度的細(xì)胞懸液。每孔加入100μl至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。通常，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入2×103個細(xì)胞/100μl，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入5×103個細(xì)胞/100μl（具體每孔所用的細(xì)胞數(shù)目需根據(jù)細(xì)胞大小、增殖速度等因素決定）。貼壁細(xì)胞需在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2-6小時，待細(xì)胞貼壁后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；懸浮細(xì)胞則無需預(yù)培養(yǎng)。

2、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，在培養(yǎng)孔中加入0-10μl待測樣本，并繼續(xù)培養(yǎng)適當(dāng)時間。進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)時，加入毒性物質(zhì)后的培養(yǎng)時間需根據(jù)毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性來確定，通常至少需要1-2代以上的時間。

3、向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入10μl CCK-8溶液，并在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5-4小時。

4、測定吸光度。建議使用雙波長進(jìn)行測定，檢測波長為430-490nm，參比波長為600-650nm；或者采用450nm單波長進(jìn)行檢測。

計算公式：

細(xì)胞存活率 = [(As - Ab) / (Ac - Ab)] × 100%

抑制率 = [(Ac - As) / (Ac - Ab)] × 100%

其中，As為實(shí)驗(yàn)孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和藥物溶液）；Ac為對照孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含藥物）；Ab為空白孔吸光度（含培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含細(xì)胞和藥物）。

注意事項(xiàng)：

（1）如果細(xì)胞起始的培養(yǎng)體積為200μl，則需加入20μl的CCK-8溶液，以此類推。

（2）建議每個藥物濃度孔設(shè)置3個復(fù)孔，并取均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

（3）設(shè)計好實(shí)驗(yàn)對照，以排除其他因素的干擾：

空白對照：使用含有等量細(xì)胞培養(yǎng)液、CCK-8溶液和藥物但沒有細(xì)胞的孔。

陰性對照：使用未加藥物但加了藥物溶劑的細(xì)胞孔。

（4）試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)。如果待測物質(zhì)具有氧化性或還原性，可能會干擾檢測結(jié)果，需設(shè)法去除其影響（可在加入CCK-8溶液之前更換新鮮培養(yǎng)基以去除藥物影響；如果藥物影響較小，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收）。

（5）加入CCK-8溶液后需注意孵育時間，該時間根據(jù)細(xì)胞類型和細(xì)胞密度等實(shí)驗(yàn)條件而定。初次實(shí)驗(yàn)時，可在0.5、1、2和4小時后分別用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，并選擇一個吸光度范圍適宜的時間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（6）在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞時，培養(yǎng)板最外邊的孔容易干燥揮發(fā)，導(dǎo)致體積不準(zhǔn)確而增加誤差。因此，最外一圈的孔通常只加培養(yǎng)基，不作測定孔用。

（7）若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10μl 10% SDS溶液以終止反應(yīng)，并將培養(yǎng)板遮蓋避光保存在室溫條件下。建議在24小時內(nèi)進(jìn)行測定，雖然吸光度變化不會太大，但還是建議盡快進(jìn)行檢測。

（8）在使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測之前，請確保每個孔內(nèi)沒有氣泡，否則會干擾測定結(jié)果。

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主營項(xiàng)目

1. 動物實(shí)驗(yàn)

動物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動生化檢測等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

康旭禾生物提供包括動物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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