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Western Blot雖是實驗室最常用的蛋白分析技術，但是由于它步驟繁瑣、操作流程長、影響因素多，所以，導致我們在做實驗時會遇到各式各樣的問題。今天我們總結了一些WB實驗中經(jīng)常遇到的各種“奇葩”條帶問題，并為你推薦了常用的解決方法，希望對大家有所幫助。

一、目標條帶沒有信號

原因分析：    

樣品中可能含有蛋白酶，使蛋白樣品分解成小分子。

解決方法： 添加蛋白酶抑制劑。

原因分析：    

目標蛋白濃度過低（低于檢測下線）。

力

 解決方法：

加大上樣量或提高目標蛋白濃度。
 原因分析：

轉膜時間太短導致目標蛋白沒有充分轉移到膜上，或者轉膜時間過長導致樣品轉穿。

解決方法：

 控制轉膜時間并選擇適合的轉印膜。
原因分析：

 一抗的特異性不佳，導致一抗無法識別目標蛋白。

解決方法：

 選用高品質抗體。
  原因分析：

一抗反復使用后導致效價降低，盡管還能與目標蛋白連接，但連接蛋白的數(shù)量太    一抗不宜反復使用。

 洗脫過渡導致與一抗相結合的目標蛋白被洗掉。 

  解決方法：

 洗脫時間的時間和頻率應有效控制，一般建議3次10分鐘。

二. 圖片背景過高，難以分辨條帶

原因分析及 解決方法    

一抗?jié)舛忍?，導致抗體非特異性結合。    降低一抗?jié)舛取?br/>    

洗膜的時間和次數(shù)不夠，導致其他蛋白沒有清洗干凈

   提高洗脫時間和頻率。
   

封閉物用量不足。

   提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉印膜。
   

封閉物使用不當。    檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉。
   

封閉時間不夠。    室溫37度封閉1小時以上，4度封閉過夜。
   

一抗稀釋度不適宜。    對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。
   

一抗孵育的溫度偏高。    建議4℃結合過夜。
   

三、 膜上出現(xiàn)黑點和黑斑

原因分析及解決方法
   

膜上其他部位與一 抗或二抗非特異性結合，配置的封閉液可能沒有完全溶解，使不容顆粒附著在膜上從而導致發(fā)光時候膜上形成黑點。

 配置封閉液后最好靜止一下，封閉牛奶一定要純，封閉結束之前要清洗三遍之后再加一抗。
    

抗體與封閉試劑反應。    

使用前過濾封閉試劑。
   

HRP偶聯(lián)二 抗中有聚集體。  

  過濾二抗試劑，去除聚集體。
   

四、出現(xiàn)非特異性條帶

原因分析    解決問題    

一抗非特異性與蛋白結合，此種情況大多數(shù)情況是因為一抗特異性不好。   

 更換一抗。    

目的蛋白有多個修飾位點，有些一抗還能結合其他蛋白的結合位點。 

 更換一抗品種。
   

蛋白樣品降解，蛋白酶將目標蛋白分解成若千個蛋白，而這些蛋白同樣可以被一抗識別。  

 添加蛋白酶抑制劑。

五、條帶中出現(xiàn)整條白色空斑

原因分析    解決問題    

過高的蛋白上樣量或一抗和二抗?jié)舛冗^高都會促使底物過快的消耗，導致我們在做化學發(fā)光檢測時，發(fā)光底物已經(jīng)消耗殆盡而形成空斑。   

 減少蛋白上樣量、稀釋一抗和二抗的濃度。    

六、條帶中出現(xiàn)白圈

原因分析    解決方法    

轉膜時候，膜與膠之間有氣泡。   

解決方法:  制作“三明治”時，注意趕走氣泡。通常將電轉液倒入一個盤子里，液體高度與第一層濾紙齊平，然后往濾紙上澆一些轉膜液，把電泳膠用清水清洗后平鋪在濾紙上，隨后在確認濾紙與膠之間無氣泡后，再往膠上澆一些電轉液，之后用雙手的拇指和食指輕輕夾住PVDF膜兩側中間，使膜成U型，再將U型底部接觸到膠的中間，慢慢往兩邊放下膜，這樣可以減少氣泡。上層濾紙同樣用U型的放置方法，可以用玻璃棒貼實一下，然后蓋上海綿墊。
   

七、條帶拖尾

原因分析    解決方法    

這種情況很容易出現(xiàn)，因為導致條帶拖尾的原因很多，可能性較大的是一抗?jié)舛忍?，作用時間太長或。   

根據(jù)情況調整蛋白量，同時降低一抗的濃度，縮短一抗的時間。    

八、條帶變形

原因分析    解決問題
   

膠體中存在氣泡，或不溶性雜質，膠不均不平整。  

  配膠時用的小燒杯，水，SDS，tris等等干凈無雜質。貼邊角加入液體，凝固時避免大幅度動作觸碰。    

九、條帶呈啞鈴裝

原因分析及 解決方法    

出現(xiàn)啞鈴裝條帶的問題，最大的可能性就是膠沒有配置好，膠凝固后不均一。另外還有一種可能就是樣品中含有太多雜質，沒有離心下來，然后雜質沉淀在孔的中間，蛋白被擠到兩邊。  

  解決方法：把膠配好，不合格的膠堅決不能用。    

十、最邊緣條帶彎曲

原因分析    解決方法    

電泳電流不均一   

解決方法：換電泳槽，或者不使用兩邊的孔。

十一、背景非均一性

原因分析及 解決方法    

膜可能干過。    

解決方法：在每一步的操作過程中，都需要注意不要讓膜干掉，確保蛋白面不要被風干很長時間，一定要用不漏水的封閉盒并蓋上蓋子，防止過夜16個小時液體流失。    

十二、條帶呈“微笑”或“倒微笑"”狀

原因分析及解決問題    

條帶呈“微笑U”狀，凝膠冷卻不均一，電泳槽老化。   

解決方法： 更換電泳槽。
   

條帶呈“倒微笑∩”裝，凝膠左右兩頭沒有凝固好。
解決方法： 重新制膠。    

十三、其他問題

原因分析及解決方法    

蛋白分子量偏高或者偏低。
  

 可能是膠的濃度與目的蛋白的濃度不對應，比如說100KD的蛋白你用12%的膠跑，或者說20KD的蛋白你用6%的膠跑。
   

蛋白質降解。

   蛋白質降解后很可能會在比原來位置低的地方出現(xiàn)主帶，然后會出現(xiàn)一些其他帶，最主要特點是所有的條帶比正常的都低，并且條帶模糊不清晰。
   

所有條帶連成一片沒有間隔。

   原因最可能是上樣量過多，其次是樣品彌散（比如電泳長時間停止樣品彌散）。
   

以上是我們對WB條帶出現(xiàn)各種狀況及解決方法的一個總結，希望可以對大家有所幫助。如果各種原因都試變了，還是做不好WB實驗怎么辦？

跑出漂亮條帶的秘訣，你學會了嗎？

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