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流式細胞術(shù) (Flow Cytometry, FCM) 是一種在液流中快速檢測細胞特性的技術(shù)，是當代最先進的細胞定量分析技術(shù)之一。它通過將單個細胞與特異性抗體結(jié)合，對細胞進行多參數(shù)定量分析，包括細胞表面標記、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達、細胞周期、DNA含量等。流式細胞術(shù)具有高通量、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于免疫學、血液學、腫瘤學等領(lǐng)域。

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流式細胞術(shù)原理

一、分析型流式細胞儀檢測原理

將待測樣品制成單細胞懸液，在鞘液的包裹下進入流式細胞儀內(nèi)的檢測區(qū)域，細胞在激光的照射下會發(fā)生散射和折射，產(chǎn)生的散射光信號和熒光信號由不同的通道接收。

其中前向角散射光(FSC)的強度與細胞直徑成正相關(guān)，可以理解為細胞直徑越大，F(xiàn)SC越強，細胞直徑越小，F(xiàn)SC越弱。側(cè)向角散射光(SSC)的強度與細胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)復雜程度成正相關(guān)，可以理解為細胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復雜，SSC越強，細胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越簡單，SSC越弱。而熒光信號的強度則與所待測細胞與熒光染料結(jié)合程度有關(guān)。

最后計算機分析系統(tǒng)會對接收的不同電信號進行分析處理，檢測結(jié)果最后用單參數(shù)峰、雙參數(shù)散點圖、三維立體圖等來表示。

二、分選型流式細胞儀檢測原理

通過分析檢測細胞，判斷是否需要將液滴進行分選。在將這些細胞液滴轉(zhuǎn)變成獨立液滴之前，對其進行相應(yīng)處理以賦予特定電荷。這些帶電荷的獨立液滴在強電場中會發(fā)生偏移，然后進入相應(yīng)的收集管中。未被收集的液滴將被處理為廢液，實現(xiàn)流式細胞分選。

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流式細胞儀結(jié)構(gòu)

流式細胞儀包括分析型和分選型兩種類型

1、分析型由液流系統(tǒng)、光路檢測系統(tǒng)、檢測分析系統(tǒng)組成

2、分選型由液流系統(tǒng)、光路檢測系統(tǒng)、檢測分析系統(tǒng)、分選系統(tǒng)組成

液流系統(tǒng)：由鞘液流和樣品流構(gòu)成,鞘液流從鞘液桶開始,流過專門的管道進入噴嘴,經(jīng)過噴嘴的小孔形成穩(wěn)定的可見液流。

檢測分析系統(tǒng)：主要是對各個通道收集到的光信號進行匯總分析,通過分析得到樣品中所有細胞的理化特征,最后以各種圖譜進行結(jié)果展示。

光路檢測系統(tǒng)：包括激光、透鏡和光學信號檢測器。激光從激光器發(fā)出,照射到樣品流中的細胞會產(chǎn)生散射光,如果細胞上結(jié)合有熒光素,若可以被激光激發(fā),熒光素則會向四周發(fā)射熒光。散射光信號包括正對激光方向接收的前向角散射光(FSC)和與激光方向在同一個水平面并與激光成90°角的側(cè)向角散射光(SSC),熒光信號與SSC接收方向相同。

分選系統(tǒng)：位于液流可見部分,是在噴嘴處多了一個高速振蕩器,在分選過程中使用噴嘴高速振蕩,帶動從噴嘴流出的可見液流高速振蕩,從而使可見液流在下段形成相互獨立的液滴而不是連續(xù)的液流。

03

流式細胞術(shù)實驗步驟

1、樣本準備樣本可以來源于組織、血液或其他液體，最終均需制備成單細胞懸液，便于染色和檢測。

2、細胞染色流式檢測需要對細胞進行染色以標記特異性抗原。

染色方法大體分為兩類：表面抗原直染、胞內(nèi)抗原染色。表面抗原直染時，細胞和熒光偶聯(lián)抗體直接孵育即可；胞內(nèi)抗原染色時，需進行固定和破膜后再和熒光偶聯(lián)抗體孵育。

3、細胞洗滌
在染色過程中，需要使用洗滌液對細胞進行洗滌以去除未結(jié)合的抗體和其他雜質(zhì)。洗滌液一般使用預冷PBS，可選擇性加入2%BSA或2%FBS以提高細胞處理中的存活率。通過洗滌可以減少非特異性結(jié)合和背景干擾，提高實驗的特異性和準確性。   

4、細胞固定

對于胞內(nèi)抗原檢測，可以使用固定液（如4%多聚甲醛）和破膜劑（如0.1% Triton X-100）對細胞進行固定和打孔。固定液可以減少細胞的活性和變形，保持細胞的形態(tài)和抗原位置的穩(wěn)定性。破膜劑有利于抗體進入與待測抗原結(jié)合。

在采集期間，細胞會通過激光器激發(fā)標記物產(chǎn)生熒光，而這些信號會被檢測器捕獲。收集的數(shù)據(jù)通常以FCS(Flow Cytometry Standard) 文件的形式保存。通過這些數(shù)據(jù)可以了解每個細胞的特性及其分布情況。

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流式細胞術(shù)特點

1、速度快：通過對單個細胞或生物顆粒進行逐個檢測，測量速度可達每秒數(shù)千甚至上萬個細胞。

2、靈敏度高

3、多參數(shù)

4、精度高

5、純度高

6、無害性

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流式檢測中常用的免疫細胞及常用標志物

免疫細胞標記物被廣泛用于流式檢測中鑒別和區(qū)分不同類型的免疫細胞

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流式細胞術(shù)應(yīng)用

1、細胞表型分析：細胞用帶有熒光的單克隆抗體標記后，用流式細胞儀可對其進行檢測分析，分析熒光細胞含量,也可分析陽性細胞CD分子的相對含量。

2、血小板功能分析與血小板病診斷：通過用熒光素標記的單克隆抗體結(jié)合流式細胞術(shù)，可以敏感、特異、快速的診斷血小板病。

3、紅細胞疾病診斷

4、細胞內(nèi)蛋白分析：細胞破膜后將細胞內(nèi)某一蛋白成分進行熒光標記，用流式細胞儀進行測量分析，測出陽性細胞數(shù)量和這種蛋白的相對含量。

5、分選：用熒光探針標記的細胞，可被有效分離出來。通過標記Ki67、BCL-2、caspases等增殖及凋亡相關(guān)基因，流式細胞術(shù)可用來檢測細胞的增殖以及凋亡。

6、流式細胞術(shù)可用來分析細胞周期

7、在腫瘤學研究中尤其常用。流式細胞術(shù)可以用于判斷藥物對腫瘤細胞影響、腫瘤的生長速度等。

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