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流式細(xì)胞術(shù) (Flow Cytometry, FCM) 是一種在液流中快速檢測(cè)細(xì)胞特性的技術(shù)，是當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一。它通過(guò)將單個(gè)細(xì)胞與特異性抗體結(jié)合，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)定量分析，包括細(xì)胞表面標(biāo)記、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞周期、DNA含量等。流式細(xì)胞術(shù)具有高通量、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域。

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流式細(xì)胞術(shù)原理

一、分析型流式細(xì)胞儀檢測(cè)原理

將待測(cè)樣品制成單細(xì)胞懸液，在鞘液的包裹下進(jìn)入流式細(xì)胞儀內(nèi)的檢測(cè)區(qū)域，細(xì)胞在激光的照射下會(huì)發(fā)生散射和折射，產(chǎn)生的散射光信號(hào)和熒光信號(hào)由不同的通道接收。

其中前向角散射光(FSC)的強(qiáng)度與細(xì)胞直徑成正相關(guān)，可以理解為細(xì)胞直徑越大，F(xiàn)SC越強(qiáng)，細(xì)胞直徑越小，F(xiàn)SC越弱。側(cè)向角散射光(SSC)的強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度成正相關(guān)，可以理解為細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，SSC越強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越簡(jiǎn)單，SSC越弱。而熒光信號(hào)的強(qiáng)度則與所待測(cè)細(xì)胞與熒光染料結(jié)合程度有關(guān)。

最后計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)會(huì)對(duì)接收的不同電信號(hào)進(jìn)行分析處理，檢測(cè)結(jié)果最后用單參數(shù)峰、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、三維立體圖等來(lái)表示。

二、分選型流式細(xì)胞儀檢測(cè)原理

通過(guò)分析檢測(cè)細(xì)胞，判斷是否需要將液滴進(jìn)行分選。在將這些細(xì)胞液滴轉(zhuǎn)變成獨(dú)立液滴之前，對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)處理以賦予特定電荷。這些帶電荷的獨(dú)立液滴在強(qiáng)電場(chǎng)中會(huì)發(fā)生偏移，然后進(jìn)入相應(yīng)的收集管中。未被收集的液滴將被處理為廢液，實(shí)現(xiàn)流式細(xì)胞分選。

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流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)

流式細(xì)胞儀包括分析型和分選型兩種類(lèi)型

1、分析型由液流系統(tǒng)、光路檢測(cè)系統(tǒng)、檢測(cè)分析系統(tǒng)組成

2、分選型由液流系統(tǒng)、光路檢測(cè)系統(tǒng)、檢測(cè)分析系統(tǒng)、分選系統(tǒng)組成

液流系統(tǒng)：由鞘液流和樣品流構(gòu)成,鞘液流從鞘液桶開(kāi)始,流過(guò)專(zhuān)門(mén)的管道進(jìn)入噴嘴,經(jīng)過(guò)噴嘴的小孔形成穩(wěn)定的可見(jiàn)液流。

檢測(cè)分析系統(tǒng)：主要是對(duì)各個(gè)通道收集到的光信號(hào)進(jìn)行匯總分析,通過(guò)分析得到樣品中所有細(xì)胞的理化特征,最后以各種圖譜進(jìn)行結(jié)果展示。

光路檢測(cè)系統(tǒng)：包括激光、透鏡和光學(xué)信號(hào)檢測(cè)器。激光從激光器發(fā)出,照射到樣品流中的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生散射光,如果細(xì)胞上結(jié)合有熒光素,若可以被激光激發(fā),熒光素則會(huì)向四周發(fā)射熒光。散射光信號(hào)包括正對(duì)激光方向接收的前向角散射光(FSC)和與激光方向在同一個(gè)水平面并與激光成90°角的側(cè)向角散射光(SSC),熒光信號(hào)與SSC接收方向相同。

分選系統(tǒng)：位于液流可見(jiàn)部分,是在噴嘴處多了一個(gè)高速振蕩器,在分選過(guò)程中使用噴嘴高速振蕩,帶動(dòng)從噴嘴流出的可見(jiàn)液流高速振蕩,從而使可見(jiàn)液流在下段形成相互獨(dú)立的液滴而不是連續(xù)的液流。

03

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟

1、樣本準(zhǔn)備樣本可以來(lái)源于組織、血液或其他液體，最終均需制備成單細(xì)胞懸液，便于染色和檢測(cè)。

2、細(xì)胞染色流式檢測(cè)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色以標(biāo)記特異性抗原。

染色方法大體分為兩類(lèi)：表面抗原直染、胞內(nèi)抗原染色。表面抗原直染時(shí)，細(xì)胞和熒光偶聯(lián)抗體直接孵育即可；胞內(nèi)抗原染色時(shí)，需進(jìn)行固定和破膜后再和熒光偶聯(lián)抗體孵育。

3、細(xì)胞洗滌
在染色過(guò)程中，需要使用洗滌液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌以去除未結(jié)合的抗體和其他雜質(zhì)。洗滌液一般使用預(yù)冷PBS，可選擇性加入2%BSA或2%FBS以提高細(xì)胞處理中的存活率。通過(guò)洗滌可以減少非特異性結(jié)合和背景干擾，提高實(shí)驗(yàn)的特異性和準(zhǔn)確性。   

4、細(xì)胞固定

對(duì)于胞內(nèi)抗原檢測(cè)，可以使用固定液（如4%多聚甲醛）和破膜劑（如0.1% Triton X-100）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和打孔。固定液可以減少細(xì)胞的活性和變形，保持細(xì)胞的形態(tài)和抗原位置的穩(wěn)定性。破膜劑有利于抗體進(jìn)入與待測(cè)抗原結(jié)合。

在采集期間，細(xì)胞會(huì)通過(guò)激光器激發(fā)標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，而這些信號(hào)會(huì)被檢測(cè)器捕獲。收集的數(shù)據(jù)通常以FCS(Flow Cytometry Standard) 文件的形式保存。通過(guò)這些數(shù)據(jù)可以了解每個(gè)細(xì)胞的特性及其分布情況。

04

流式細(xì)胞術(shù)特點(diǎn)

1、速度快：通過(guò)對(duì)單個(gè)細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè)，測(cè)量速度可達(dá)每秒數(shù)千甚至上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。

2、靈敏度高

3、多參數(shù)

4、精度高

5、純度高

6、無(wú)害性

05

流式檢測(cè)中常用的免疫細(xì)胞及常用標(biāo)志物

免疫細(xì)胞標(biāo)記物被廣泛用于流式檢測(cè)中鑒別和區(qū)分不同類(lèi)型的免疫細(xì)胞

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流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用

1、細(xì)胞表型分析：細(xì)胞用帶有熒光的單克隆抗體標(biāo)記后，用流式細(xì)胞儀可對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析，分析熒光細(xì)胞含量,也可分析陽(yáng)性細(xì)胞CD分子的相對(duì)含量。

2、血小板功能分析與血小板病診斷：通過(guò)用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，可以敏感、特異、快速的診斷血小板病。

3、紅細(xì)胞疾病診斷

4、細(xì)胞內(nèi)蛋白分析：細(xì)胞破膜后將細(xì)胞內(nèi)某一蛋白成分進(jìn)行熒光標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)量分析，測(cè)出陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和這種蛋白的相對(duì)含量。

5、分選：用熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞，可被有效分離出來(lái)。通過(guò)標(biāo)記Ki67、BCL-2、caspases等增殖及凋亡相關(guān)基因，流式細(xì)胞術(shù)可用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的增殖以及凋亡。

6、流式細(xì)胞術(shù)可用來(lái)分析細(xì)胞周期

7、在腫瘤學(xué)研究中尤其常用。流式細(xì)胞術(shù)可以用于判斷藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞影響、腫瘤的生長(zhǎng)速度等。

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主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書(shū)寫(xiě)作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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