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一、qPCR 實驗前期籌備

（一）RNA模板要求

實驗啟動前，需確保RNA模板的純度、濃度及完整性均符合標準，方可推進后續(xù)步驟。具體要求如下：

①RNA需保持一級結構完好無損。

②高純度：無DNA、游離核苷酸等核酸雜質；無酶抑制性有機溶劑、金屬離子及蛋白質、多糖、脂類等污染物。

③足夠濃度：需滿足反轉錄實驗的基本需求。

（二）qPCR引物設計規(guī)范

引物建議長度介于18~30個堿基；GC含量應控制在40%~60%之間；設計時應跨越內含子，避免內部出現(xiàn)互補序列。通常，引物終濃度設為0.2μM效果較佳；若反應效果不佳，可在0.1~1.0μM范圍內適當調整引物濃度。

二、實驗規(guī)劃——內參基因選定

內參基因，又稱管家基因，其表達水平恒定，不受內源及外源因素干擾。此類基因高度保守，于各類細胞與組織間穩(wěn)定表達，且表達量無明顯差異。在進行qPCR相對定量時，內參基因不可或缺，常用者如GAPDH、β-actin及18s rRNA等。

內參基因功能概述：

? 消除終產物定量誤差

? 校正樣本加載量偏差

? 抵消PCR抑制物干擾

? 平衡cDNA合成效率差異

內參基因篩選標準：

? 不與目的基因擴增相干擾

? 表達水平適中，避免過高或過低

? 于各類細胞與組織間表達穩(wěn)定，量無顯著差異

? 表達與細胞周期及活化狀態(tài)無關

? 完全獨立于內源及外源因素，包括實驗處理影響

三、實驗設計——陽性/陰性對照

在規(guī)劃qPCR實驗時，為確保實驗質量，避免模板污染、操作失誤等導致的實驗失敗，必須設置陰性與陽性對照組。

陽性(+)對照組設置：

可選用含PCR擴增子的合成RNA/cDNA寡核苷酸、質粒DNA、克隆重組質粒、體外轉錄RNA、特定生物樣本的RNA/DNA，或國際公認的生物標準品等作為陽性對照。此對照有助于迅速診斷實驗失敗原因，究竟是試劑失效還是儀器故障。

陰性(-)對照組設置：

四、數(shù)據分析——△△Ct法

PCR擴增指數(shù)期內，模板Ct值與其起始濃度對數(shù)呈線性關聯(lián)，起始拷貝數(shù)愈多，Ct值愈小。通過構建標準曲線，可對未知樣本進行精確定量，進而評估基因表達差異或基因拷貝數(shù)。通常采用2-△△Ct法，實現(xiàn)目的基因的相對定量測定。

五、數(shù)據分析——擴增與融解曲線解析

1、擴增曲線分析

擴增曲線應呈現(xiàn)平滑S型，需確保所有樣本起始無擴增信號，且陰性對照（包括無模板對照NTC與無反轉錄對照NRC）無熒光響應，即無S型擴增曲線，同時擴增起峰時間需符合預期。

2、融解曲線分析

融解曲線應呈現(xiàn)單一峰值，該峰值對應目的產物的特定Tm值，此Tm值與產物種類緊密相關，不受模板量、引物濃度等外部條件影響。理想的單峰應狹窄且尖銳，陰性對照中不應出現(xiàn)顯著高峰。

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