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 蘇木精 — 伊紅染色法 ，簡稱HE染色法 ，石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一 。蘇木精是陽離子染料，能夠?qū)⒓毎藘?nèi)的嗜堿性物質(zhì)染成藍紫色。伊紅是陰離子染料，能夠?qū)⒓毎|(zhì)和膠原纖維等染成粉紅色。HE染色法是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。

HE染色法的原理是怎么樣的？

●細胞核染色原理蘇木精為堿性天然染料，可使細胞核著色。細胞核內(nèi)染色質(zhì)的成分主要是DNA，在DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋的外側(cè)帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性燃料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。

●細胞漿染色原理細胞漿內(nèi)主要成分是蛋白質(zhì)，為兩性化合物、細胞漿的染色與pH值有密切關(guān)系，當pH調(diào)到蛋白質(zhì)等電點4.7-5.0時，胞漿對外不顯電性，此時酸或堿性染料不易染色。當pH調(diào)到6.7-6.8時，大于蛋白質(zhì)的等電點pH值，表現(xiàn)酸性電離，而帶負電荷的陰離子，可被帶正電荷的染料染色，現(xiàn)時胞核也被染色，核和胞漿難以區(qū)分。因此必須把pH調(diào)至胞漿等電點以下，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷（陽離子），就可被帶負電荷（陰離子）的染料染色。伊紅Y是一種化學合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷（陽離子）結(jié)合而使細胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結(jié)締組織，嗜伊紅顆料等被感染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明的對比。

●分化作用染色后，用某些特定的溶液將組織過多結(jié)合的染色劑脫去，這個過程稱為分化作用，所用的溶液稱為分化液。在HE染色中用0.5%鹽酸乙醇作為分化液，因酸能破壞蘇木精的醌型結(jié)構(gòu)，使組織與色素分離而褪色。經(jīng)蘇木精染色后，必須用0.5%鹽酸乙醇分化，使細胞核過多結(jié)合的蘇木精染料和細胞漿吸附的蘇木精染料脫去，在進行伊紅染色，才能保證細胞核與細胞漿染色的分明。因此，在HE染色中分化是極為關(guān)鍵的一步。

●返藍作用分化之后，蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，呈紅色，在堿性條件下處于藍色離子狀態(tài)，呈藍色。組織切片經(jīng)0.5%鹽酸乙醇分化后呈紅色或粉紅色，故分化之后，立即用水除去組織切片上的酸而終止分化，再用弱堿性水（0.2%氨水）使蘇木精染上的細胞核呈現(xiàn)藍色，這個過程稱為返藍作用或藍化作用。另外用自來水浸洗也可使細胞核返藍，但所需時間較長。

HE染色試劑

 ●二甲苯

●梯度乙醇

●蘇木素染液

●伊紅染液

●分化液

●返藍液

●中性樹膠固封劑

HE染色有哪些注意事項

●脫蠟要徹底。一般脫蠟徹底的切片呈透明狀，脫蠟的徹底與否取決于環(huán)境溫度、脫蠟液溫度、脫蠟時間、切片數(shù)量等；

●HE各染液的染色時間應根據(jù)組織類型不同、樣本新舊、固定不同、環(huán)境溫度不同、染液使用情況不同、切片厚度及切片數(shù)量來調(diào)整。一般來說新鮮組織易著色，陳舊組織較難著色；

●染色過程中水洗需注意自來水的酸堿性。如自來水呈酸性，則易使蘇木素脫色，如自來水呈堿性，則易加快水溶伊紅在乙醇中的脫色，應根據(jù)染液情況和自來水情況調(diào)整沖洗時間；

●脫水時，應控制切片在低濃度乙醇的時間，低濃度乙醇對伊紅有洗脫作用；

●根據(jù)不同蘇木素，是否需要分化反藍，以及分化反藍的時間均不相同，水溶或淳溶的伊紅著色效果也不相同，在染色過程中進行鏡檢能達到更好的染色效果；

●中性樹膠固封劑濃度要適中，濃度高時，不易散開、易產(chǎn)生氣泡，濃度低時，易溢出切片、待二甲苯揮發(fā)后樹膠易分布不均產(chǎn)生空泡；

●染色應在通風櫥進行，避免或減少試劑對人體的傷害。

染色程序

●二甲苯3缸，浸染5min；

●無水乙醇2缸，浸染2min；

●75%，85%，95%梯度乙醇各1缸，浸染1min；

●自來水浸1min；

●蘇木素浸染5-8min；

●自來水沖洗；

●分化：根據(jù)分化液不同，數(shù)秒或數(shù)分鐘不等；

●自來水沖洗；

●反藍：根據(jù)返藍液不同，數(shù)秒或數(shù)分鐘不等；

●自來水沖洗；

●伊紅浸染1-5min；

●自來水沖洗；

●75%、85%、95%梯度乙醇各1缸，浸染10-20s；

●無水乙醇2缸，浸染1-2min；

●二甲苯2缸，浸染2min；

●中性樹膠固封。

PART 05

HE切片技術(shù)標準

●組織完整；

●厚薄均勻；

●染色清晰，對比度高；

●無明顯褶皺、破損、刀痕、裂隙等；

●著色無污染；

●固封適中，無氣泡、空腔，透明度好。

PART 06

HE染色有哪些常見問題？

問

著色過深或者過淺

答

染色時間控制不佳，HE染色需要通過鏡檢來控制時間，可以先通過預實驗得到最佳染色時間，一般情況下新鮮蘇木素染色時間在1-3min左右，分化時間同樣不易過長，過度分化可以水洗后重新復染蘇木素。

問

染色后切片不清晰，霧化，斑點

答

?烤片溫度過低，時間不夠，導致脫蠟不徹底，切片留存白色斑點。

? 染色后切片脫水時間不合理，切片上殘留水分，使切片霧化，需要優(yōu)化脫水的梯度乙醇時間，切片經(jīng)過低濃度時時間要短，向高濃度逐漸延長脫水時間。

? 蓋玻片上殘留封固劑，導致切片不清晰，需要重新封片解決。

? 組織標本已發(fā)生自溶或取材后沒及時固定或固定液濃度不夠；另固定前干枯標本，染色后易出現(xiàn)灰染現(xiàn)象，很難補救。

? 固定劑對組織有一定媒染作用，它既可與蛋白結(jié)合又能與染料結(jié)合，可增強著色能力，同時能沉淀和凝固細胞內(nèi)成分，使細胞內(nèi)成分產(chǎn)生不同折光率造成光學差異。故固定不良是造成切片染色模糊不清的主要原因。

? 在日常病理制片中淋巴結(jié)處理不當造成切片染色后組織見發(fā)灰現(xiàn)象，其主要原因由于細胞密集，結(jié)構(gòu)復雜導致固定液難以滲透到組織深部，從而造成組織中央固定不佳，而出現(xiàn)徹底發(fā)灰現(xiàn)象?？捎玫攘繜o水乙醇乙醚混合液處理切片5-10分鐘，乙醇洗，水洗，3%硫酸鐵銨溶液補充媒染5分鐘既可。

問

染色后切片有黑色雜質(zhì)，氣泡

答

? 雜質(zhì)多為蘇木素染色液中的金屬膜粘附于載玻片上，每天染色前仔細過濾蘇木素染液或者使用半氧化蘇木素染色液。

? 染色后切片經(jīng)過梯度乙醇脫水不徹底，導致封片后載玻片上殘留水分，也可能是封片是出現(xiàn)的氣泡。

問

染色后細胞核呈棕色

答

蘇木素染液過度氧化或者染色后返藍時間不足，染色前檢查蘇木素的染色能力并即時更換試劑，然后適當延長返藍時間。

問

切片染色不勻

答

? 組織取材固定不當，如組織取材過大或過厚，不能將組織完全固定，組織切片染色后出現(xiàn)外周固定好的部分易著色，而中間未固定好的組織 ，細胞著色模糊，使染色不均。在送檢的標本中，及時用4%中性甲醛對標本固定，固定液應是標本的4倍。大標本應切開固定。

? 切片薄厚不均或有橫紋。切片刀有缺口時，易造成斷裂，破碎和不完整。切片刀傾角過大上卷，不能連在一起，過小則切片皺起。或因螺絲松動產(chǎn)生振動切片易造成厚薄不均或技術(shù)人員手臂搖動切片機頭力量不均易造成橫紋。切片時檢查切片機螺母是否擰緊。

? 組織脫水，透明和浸蠟處理不當，組織脫水用的各級乙醇未能保證相應濃度使組織脫水不徹底，二甲苯內(nèi)的時間過長組織易碎也無法切出好片子，浸蠟溫度過高，組織變脆也不利切片染色。

主營項目

1. 動物實驗

動物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動生化檢測等

2. 細胞實驗

CCK8/MTT、原代細胞分離、流式細胞實驗、細胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學

PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等

4. 蛋白實驗

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實驗

HE染色、免疫組學、電鏡

6. 生理生化實驗

肝腎功能、抗氧化、免疫反應等生理免疫指標;動植物營養(yǎng)指標、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學實驗

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實驗

方案設(shè)計、整體實驗交付、標書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

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康旭禾生物提供包括動物實驗、細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關(guān)的各項服務。

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