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實(shí)驗(yàn)名稱雖相撞，看我如何巧分辨。

IP、CoIP、CHIP、RIP傻傻分不清？別著急，看完這篇你就懂了，包教包會(huì)！

我們先掌握共性部分，再記住區(qū)分要點(diǎn)，這樣就可以啦！

免疫沉淀（IP）

免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是一種研究蛋白質(zhì)間交互作用的生物技術(shù)，這種技術(shù)是將蛋白質(zhì)視為抗原，并利用抗體與之進(jìn)行特異性結(jié)合的特性，來進(jìn)行研究。這項(xiàng)技術(shù)可用來將含有上千種不同蛋白質(zhì)的樣品中，分離和濃縮出特定蛋白質(zhì)。進(jìn)行免疫沉淀法時(shí)，抗體需要和一個(gè)受質(zhì)結(jié)合。

IP的實(shí)驗(yàn)原理很簡(jiǎn)單，就和“捕魚”一樣，通過抗體特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白，然后把它從復(fù)雜的樣本環(huán)境中分離出來。

早期的IP實(shí)驗(yàn)，抗體是預(yù)先結(jié)合在樹脂表面的，這些樹脂鋪在反應(yīng)管的底部，然后再加入含有目標(biāo)蛋白的溶液進(jìn)去。

等待目標(biāo)蛋白和抗體結(jié)合在一起，再通過離心去除雜質(zhì)、洗滌液洗干凈殘留雜質(zhì)，最后用洗脫液把蛋白從樹脂上洗下來。

現(xiàn)在，IP實(shí)驗(yàn)除了采用樹脂，也可以采用抗體加入樣本環(huán)境中和蛋白結(jié)合，然后再加入一種叫Protein A/G的磁性微珠，它能“抓住”抗體的FC段，形成一個(gè)“磁珠-抗體-蛋白”的復(fù)合體，接著就靠磁力去富集這個(gè)復(fù)合體，再除雜和洗脫蛋白。

問題來了，把蛋白拿到手能干嘛？

在Western blot和質(zhì)譜技術(shù)出來之前，IP實(shí)驗(yàn)?zāi)玫降牡鞍兹狈Χ糠治龅氖侄?。因此，大家努力的方向更多的是集中在如何提高“捕魚”效率——例如更好的去除雜質(zhì)。

在Western blot和質(zhì)譜技術(shù)誕生后，IP實(shí)驗(yàn)就變成了2部分：分離蛋白和分析蛋白。

借助Western blot，可以確認(rèn)目標(biāo)蛋白有沒有、半定量分析有多少；借助質(zhì)譜，可以獲得蛋白肽段指紋圖譜，通過和數(shù)據(jù)庫比對(duì)匹配，就能解析蛋白的種類和組成，并且定量分析蛋白的摩爾濃度。

所以，IP實(shí)驗(yàn)常常用于什么研究呢？

既然它是“社交悍匪”，那細(xì)胞的各種生理活動(dòng)肯定少不了蛋白質(zhì)參與。正常的、異常的、疾病的各種變化，都需要先知道這個(gè)生理活動(dòng)的機(jī)理——至少看看它是怎么社交嘛。

例如，看看這個(gè)生理現(xiàn)象的產(chǎn)生由什么蛋白決定或參與（蛋白鑒定），這些蛋白有沒有相互關(guān)系（蛋白互作），它們參與的時(shí)候是什么狀態(tài)（磷酸化？特殊修飾？）、通過什么方式參與的（蛋白互作還是與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，還是與RNA結(jié)合？）。

基于以上研究的需要，在IP實(shí)驗(yàn)原理的基礎(chǔ)上，就延展出了多個(gè)不同的應(yīng)用方向：Co-IP、ChIP和RIP。

免疫共沉淀（CoIP）

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP），是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。

當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。當(dāng)用預(yù)先固化在agarose beads上的蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離，對(duì)B蛋白進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而證明兩者間的相互作用。

這種方法得到的目的蛋白是在細(xì)胞內(nèi)與興趣蛋白天然結(jié)合的，符合體內(nèi)實(shí)際情況，得到的結(jié)果可信度高。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。

蛋白產(chǎn)生相互作用，共同完成任務(wù)，如果蛋白A和B是依靠結(jié)合在一起產(chǎn)生作用的，那么通過IP實(shí)驗(yàn)把蛋白A分離出來，理論上也就把蛋白B也“抓”回來了。只要通過Western blot、蛋白質(zhì)譜這些技術(shù)驗(yàn)證一下就能明確。

例如，乳腺癌中HER2蛋白過表達(dá)與侵襲性相關(guān)，在不明確致癌機(jī)制的前提下，如果推測(cè)HER2可能和PI3K激酶結(jié)合，并激活下游通路。

那么就可以拿HER2過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系（如MCF-7）進(jìn)行驗(yàn)證。加入抗HER2抗體，通過磁珠捕獲HER2蛋白復(fù)合物。

洗脫復(fù)合物后，用Western Blot檢測(cè)其中是否含有PI3K相關(guān)蛋白。有的話，就代表推測(cè)方向正確了。

不過，Co-IP和IP有一點(diǎn)重要的區(qū)別，就是蛋白互作形成復(fù)合體，是在細(xì)胞內(nèi)處于天然生理環(huán)境下才具備的，因此，Co-IP只能從細(xì)胞或組織里獲取蛋白，并且要用非變性的裂解條件來獲取里面的蛋白，否則蛋白之間的相互作用可能就被提前破壞了。

那么，Co-IP實(shí)驗(yàn)后，如果發(fā)現(xiàn)了蛋白A和B，是不是就說明A和B是直接相互作用的呢？不能。

因?yàn)镃o-IP只是證明了復(fù)合體里有蛋白A和B，但有沒有其他蛋白？不確定。說不定A和B之間還有一個(gè)C作為橋梁呢，但Western blot就只能看到蛋白A和蛋白B的條帶。所以Co-IP無法確定蛋白A和B是直接相互作用還是間接相互作用。

染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是目前研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對(duì)目的片段的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。

ChIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且，ChIP與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍：ChIP與基因芯片相結(jié)合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；ChIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。由此可見，隨著ChIP的進(jìn)一步完善，它必將會(huì)在基因表達(dá)調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

實(shí)驗(yàn)流程如下：甲醛處理細(xì)胞——收集細(xì)胞，超聲破碎——加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合——加入Protein A，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，并沉淀——對(duì)沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗，除去一些非特異性結(jié)合——洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物——解交聯(lián)，純化富集的DNA片斷——后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析，如PCR分析，測(cè)序分析等。

那么，如果我們知道目標(biāo)蛋白有什么，但不知道它們結(jié)合在哪里，就可以通過ChIP-seq高通量測(cè)序分析DNA片段，這樣就可以確定過蛋白結(jié)合位點(diǎn)，類似的技術(shù)還有ChIP-qPCR和ChIP-chip。

比如，前列腺癌中，雄激素受體（AR）通過結(jié)合DNA調(diào)控下游基因（如PSA）表達(dá)，但具體結(jié)合位點(diǎn)不明確。

我們就可以對(duì)AR陽性的前列腺癌細(xì)胞系（如LNCaP）進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，使用抗AR的抗體捕獲DNA-蛋白復(fù)合物。

ChIP-seq后分析，發(fā)現(xiàn)AR結(jié)合至多個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)，包括PSA基因的順式作用元件。這樣就明確了具體結(jié)合位點(diǎn)了。

進(jìn)一步研究，對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行敲除后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖減緩了、腫瘤體積縮小了，因此，就可以證實(shí)了AR的調(diào)控作用機(jī)理。

RNA免疫共沉淀（RIP）

RNA免疫共沉淀原理與ChIP相似，是一種用于定位體內(nèi)的 RNA-蛋白質(zhì)相互作用，它通過免疫沉淀目標(biāo)蛋白來捕獲蛋白體內(nèi)結(jié)合的RNA。將捕獲的RNA進(jìn)行高通量測(cè)序，可獲得RNA結(jié)合蛋白（RBP）在體內(nèi)與眾多RNA靶標(biāo)的結(jié)合模式，并對(duì)其結(jié)合強(qiáng)度進(jìn)行精確定量，最終通過分析目的蛋白在體內(nèi)結(jié)合RNA的動(dòng)態(tài)變化，闡述出目的蛋白對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。

RIP的實(shí)驗(yàn)流程與ChIP相似，與ChIP不一樣的是，RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對(duì)不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等等，同時(shí)不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行交聯(lián)固定。

人類的絕大部分基因組不編碼基因，而是產(chǎn)生非編碼的RNA，這些非編碼RNA參與幾乎所有基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。而它們是以蛋白-RNA復(fù)合體（RBP）的形式完成這些事情的。

RIP技術(shù)就是RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀，基于IP實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)而衍生出來的應(yīng)用。RNA容易降解，所以要依靠紫外線（UVC）短暫照射細(xì)胞，使RNA與鄰近蛋白的氨基/巰基交聯(lián)，形成穩(wěn)定的“RNA-蛋白鎖鏈”。

這一方法既保留天然結(jié)合狀態(tài)，又避免化學(xué)交聯(lián)劑的毒性。完成這一步后，后續(xù)的操作就和IP差不多了。

RIP可以用于明確蛋白和RNA結(jié)合的對(duì)應(yīng)關(guān)系，也可以用高通量測(cè)序找到RBP對(duì)應(yīng)調(diào)控的靶基因。

以2008年《細(xì)胞》雜志發(fā)表的一篇論文為例，通過RIP-seq，成功揭示了miR-17-92簇在白血病中的“癌基因開關(guān)”作用——該miRNA家族通過結(jié)合300多個(gè)腫瘤抑制基因的3'UTR，抑制其翻譯并促進(jìn)細(xì)胞增殖。

主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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