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對(duì)腫瘤的研究，主要包括功能研究和機(jī)制研究，細(xì)胞功能的研究主要是體現(xiàn)腫瘤生物學(xué)特性。其中腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲功能研究是必不可少的，腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力的研究，也為后續(xù)信號(hào)通路、功能機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。  Transwell 遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)主要用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞體外的遷移、侵襲能力，由此可見，做好Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)是至關(guān)重要的。

1.實(shí)驗(yàn)原理  

      將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。
      應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。侵襲實(shí)驗(yàn)中使用到的Matrigel 是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。
      Transwell小室的濾膜孔徑一般為8μm，在侵襲實(shí)驗(yàn)中，膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運(yùn)動(dòng)才能穿過這種鋪有Martrigel 的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。細(xì)胞欲進(jìn)入下室，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

2. 材料與試劑

?Transwell小室

?細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基

?胎牛血清

?胰蛋白酶

?PBS?青霉素-鏈霉素溶液（100×）

?結(jié)晶紫或臺(tái)盼藍(lán)

?4%多聚甲醛?Matrigel（侵襲實(shí)驗(yàn)）

3. 實(shí)驗(yàn)步驟

1、實(shí)驗(yàn)前一天，將已經(jīng)分裝后的一管Matrigel基質(zhì)膠從-20℃提前放入4℃冰箱過夜，Matrigel膠即從固體狀態(tài)融化為液體狀態(tài)。Matrigel基質(zhì)膠以1：8稀釋后包被transwell小室底部膜的上室面(整個(gè)過程注意冰上操作，否則Matrigel在10℃以上即會(huì)凝固)，3小時(shí)風(fēng)干。注：如進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)，則跳過這一步驟。
　　2、水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50μL 10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37 ℃，30min。
　　3、常規(guī)胰酶消化細(xì)胞，PBS洗1-2遍去除血清的影響，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5*105個(gè)/mL。
　　4、取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室， 24孔培養(yǎng)板下室內(nèi)加入600μL 含10% FBS培養(yǎng)基。注意下層培養(yǎng)液與小室之間不要產(chǎn)生氣泡。
　　5、培養(yǎng)板置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中，依據(jù)腫瘤細(xì)胞侵襲能力而定培養(yǎng)12-48h。
　　6、取出小室，PBS淋洗2遍，用棉簽小心擦去小室微孔膜上層內(nèi)的細(xì)胞，在24孔板內(nèi)4%多聚甲醛(或95%酒精)固定20 min，結(jié)晶紫溶液染色15 min。
　　7、倒置顯微鏡下拍照，每個(gè)樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，取平均值，統(tǒng)計(jì)分析。

4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

拍照結(jié)果呈現(xiàn)

5.注意事項(xiàng)

1、細(xì)胞接種劑量不同的細(xì)胞，其侵襲能力是不同的，細(xì)胞量過多，穿過膜的細(xì)胞會(huì)過多過快，最后會(huì)難以統(tǒng)計(jì)結(jié)果;而細(xì)胞量過少，可能還沒到檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)，所有的細(xì)胞都已穿過，進(jìn)入下室。因此最少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。

幾種常見細(xì)胞的每孔接種數(shù)量如下表：(個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，不同實(shí)驗(yàn)室可能略有差異)　

2、避免產(chǎn)生氣泡下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，將小室放入培養(yǎng)板時(shí)要注意，如有氣泡產(chǎn)生，須將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。　　3、檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)時(shí)間主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定，時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞、細(xì)胞侵襲力及處理因素等?！　?、注意事項(xiàng)用棉簽擦掉上室細(xì)胞時(shí)注意不要蹭到已穿膜的那一層細(xì)胞?！　?、對(duì)于比較難穿膜的細(xì)胞，可以在實(shí)驗(yàn)開展前撤掉血清，饑餓處理12h-24h。

6.推薦

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)作為腫瘤研究的金標(biāo)實(shí)驗(yàn)之一，在研究中應(yīng)用的越來越廣泛，康旭禾生物提供完整的Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)，讓你省時(shí)又省心，如果您有任何疑問，也歡迎您點(diǎn)擊下方的技術(shù)員咨詢，專業(yè)的技術(shù)人員將隨時(shí)為您提供解答。

主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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