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親愛的小伙伴們，你們最近科研進(jìn)展的還順利嗎？最近看到一個(gè)新聞非常氣憤，廣東工業(yè)大學(xué)有兩研究生，他們暑假留校參與課題科研工作，但因?yàn)槲缧輹r(shí)間打游戲看視頻娛樂被嚴(yán)厲地處罰。真的是沒有天理了啊，午休時(shí)間都不能讓人休息。還是建議各位小伙伴們要適當(dāng)?shù)膴蕵沸菹?，這樣才能更好地投入科研事業(yè)！接下來給大家推薦一篇思路絕佳的文章，它將細(xì)胞焦亡、炎癥小體、乙?；皖惼鞴俳Y(jié)合在一起，快來看一下吧~

1.多種方法進(jìn)行驗(yàn)證：研究使用各種技術(shù)評估了用抗腫瘤藥物治療的CRC細(xì)胞中的細(xì)胞焦亡，包括蛋白質(zhì)印跡、乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)和顯微鏡分析。為了揭示調(diào)節(jié)NLRP3的表觀遺傳機(jī)制，使用轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測定法和RNA測序評估了染色質(zhì)變化和NLRP3啟動子組蛋白修飾。染色質(zhì)免疫沉淀定量聚合酶鏈反應(yīng)用于研究NLRP3轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。此外，還構(gòu)建異種移植和患者來源的異種移植模型來驗(yàn)證藥物組合的效果。

2.具有臨床意義：研究揭示了HDAC2在抑制NLRP3/GSDMD介導(dǎo)的CRC細(xì)胞焦亡中起著至關(guān)重要的作用，并強(qiáng)調(diào)HDAC2是抗腫瘤治療的潛在治療靶點(diǎn)。

題目：抑制HDAC2可促進(jìn)NLRP3/GSDMD介導(dǎo)的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞焦亡，從而增強(qiáng)抗腫瘤治療的敏感性雜志：Clinical and Translational Medicine影響因子：IF=7.9發(fā)表時(shí)間：2024年6月研究背景結(jié)直腸癌(CRC)占全球癌癥發(fā)病率和死亡率的10%左右。大約一半被診斷患有CRC的患者最終會發(fā)展為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(mCRC)，主要治療方式是化療和靶向治療。目前大量研究表明激活的細(xì)胞焦亡可以增強(qiáng)多種腫瘤的抗腫瘤治療效果，但結(jié)直腸癌（CRC）中細(xì)胞焦亡的具體機(jī)制仍不清楚。
研究思路   

研究結(jié)果1.CRC中NLRP3沉默抑制了抗腫瘤治療期間GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡免疫組織化學(xué)分析顯示，與相應(yīng)的相鄰正常對照相比，CRC組織中的NLRP3表達(dá)顯著降低，而GSDMD表達(dá)保持不變（圖1A、B）。mRNA和蛋白質(zhì)水平顯示，NLRP3表達(dá)在原發(fā)性CRC組織中降低（圖1C）。同樣，觀察到NLRP3在大多數(shù)CRC細(xì)胞系中被沉默，而GSDMD則廣泛表達(dá)（圖1D）。研究選擇了四種具有差異NLRP3表達(dá)的CRC細(xì)胞系來測試藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡：NLRP3表達(dá)相對較高的HCT116和DLD1，以及表達(dá)相對較低的SW620和LS174T（圖1D）。

Western blot分析顯示，NLRP3沉默抑制了細(xì)胞焦亡途徑的激活：Caspase1、GSDMD cleavage和Pro IL1β/IL-18釋放減少（圖1E）。經(jīng)過36小時(shí)的瑞戈非尼或5-FU處理后，超過30%的NLRP3高表達(dá)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的焦亡形態(tài)，包括核固縮、細(xì)胞腫脹和膜起泡，而只有約2%的NLRP3低表達(dá)細(xì)胞表現(xiàn)出類似的形態(tài)變化（圖1F）。

通過在流式細(xì)胞術(shù)分析中進(jìn)行Caspase-1/PI雙重染色，與NLRP3表達(dá)低的細(xì)胞相比，使用瑞戈非尼或5-FU在表達(dá)高水平NLRP3的細(xì)胞中誘導(dǎo)的焦亡百分比（Caspase-1+/PI+）明顯更高（圖1G、H）。NLRP3高表達(dá)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出比NLRP3低表達(dá)細(xì)胞明顯更高的LDH釋放，這表明高水平的NLRP3導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷增加（圖1I）。綜上所述，這些結(jié)果表明，沉默NLRP3會損害CRC細(xì)胞的細(xì)胞焦亡。  

 圖1：結(jié)直腸癌(CRC)中NLRP3表達(dá)的缺失限制了抗腫瘤治療期間gasdermin D(GSDMD)介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡2.在CRC細(xì)胞中補(bǔ)充NLRP3表達(dá)可在體內(nèi)和體外挽救GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡與野生型細(xì)胞相比，NLRP3過表達(dá)不會影響細(xì)胞焦亡標(biāo)志物GSDMD、Pro IL-1β、Pro IL-18和Caspase-1的裂解，但在使用瑞戈非尼或5-FU等各種化療藥物治療后觀察到顯著增加（圖2A）。    

此外，與對照組相比，NLRP3過表達(dá)增強(qiáng)了多種藥物誘導(dǎo)的LDH釋放，并降低了CRC細(xì)胞的細(xì)胞活力（圖2B、C）。使用高分辨率掃描電子顯微鏡分析受損的NLRP3過表達(dá)細(xì)胞，超微結(jié)構(gòu)膜突起更明顯（圖2D、E）。Caspase-1/PI流式細(xì)胞術(shù)測定，與對照組相比，NLRP3過表達(dá)細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡百分比(Caspase-1+/PI+)顯著增加(圖2F，G)。通過皮下注射NLRP3過表達(dá)的SW620細(xì)胞，構(gòu)建異種移腫瘤模型。與對照異種移植相比，在12天的時(shí)間內(nèi)，NLRP3過表達(dá)的腫瘤在接受瑞戈非尼或5-FU治療后顯示出腫瘤生長減弱，最終腫瘤負(fù)擔(dān)減輕（圖2H、I）。
免疫組織化學(xué)(IHC)和蛋白質(zhì)印跡分析表明，與對照腫瘤相比，持續(xù)給藥后，腫瘤內(nèi)細(xì)胞焦亡相關(guān)標(biāo)志物(Cleaved caspase-1和Cleaved GSDMD)的水平升高(圖2J)。綜上所述，NLRP3重新表達(dá)促進(jìn)CRC細(xì)胞的細(xì)胞焦亡。   

 圖2：在結(jié)直腸癌(CRC)細(xì)胞中補(bǔ)充NLRP3表達(dá)可在體內(nèi)和體外挽救Gasdermin D (GSDMD)介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡3.HDAC2介導(dǎo)的組蛋白去乙酰化導(dǎo)致CRC中NLRP3的表觀遺傳沉默表觀遺傳藥物的篩選表明SAHA和VPA是CRC細(xì)胞中NLRP3的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑，可顯著提高轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)表達(dá)（圖3A-C）。SAHA和VPA劑量依賴性地提高了四種結(jié)腸癌細(xì)胞系中的NLRP3水平（圖3D、E）。
Spearman相關(guān)系數(shù)分析揭示了NLRP3與大多數(shù)HDAC之間存在負(fù)相關(guān)性。同時(shí)，這些去乙?；傅膕iRNA篩選表明，只有HDAC2敲低才會增加CRC細(xì)胞中的NLRP3轉(zhuǎn)錄（圖3F）。
免疫印跡結(jié)果表明，相對于正常鄰近組織，患者來源的CRC組織表現(xiàn)出較高的HDAC2蛋白豐度，這與NLRP3水平呈負(fù)相關(guān)（圖3G）。此外，CRC細(xì)胞系的蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)了HDAC2和NLRP3表達(dá)呈反比（圖3H）。
TCGA數(shù)據(jù)分析顯示，與正常樣本相比，CRC樣本中的HDAC2表達(dá)上調(diào)（圖3I）。值得注意的是，用選擇性HDAC2抑制劑SCA治療可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞中NLRP3水平的劑量依賴性上調(diào)（圖3J）。與非靶向siNC轉(zhuǎn)染相比，siHDAC2轉(zhuǎn)染顯著提高了NLRP3的蛋白質(zhì)水平（圖3K）。這些結(jié)果表明，CRC中HDAC2異常高表達(dá)導(dǎo)致NLRP3的表觀遺傳沉默。 

 圖3：HDAC2介導(dǎo)的組蛋白去乙酰化導(dǎo)致結(jié)直腸癌(CRC)中NLRP3的表觀遺傳沉默4.敲除HDAC2可通過上調(diào)NLRP3激活GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)，HDAC2缺失導(dǎo)致GSDMD和IL1β裂解（圖4A）。然而，在HDAC2缺陷細(xì)胞中敲低NLRP3會減弱這些蛋白質(zhì)的裂解(圖4B)。與對照細(xì)胞相比，HDAC2 KO細(xì)胞中的LDH水平升高，并且也可以通過敲低NLRP3來逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象(圖4C、D)。使用具有不同HDAC2表達(dá)水平的PDO培養(yǎng)物進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。暴露于瑞戈非尼后，與具有較高HDAC2表達(dá)水平(PDO-1)的類器官相比，具有較低HDAC2表達(dá)水平(PDO-2)的類器官表現(xiàn)出更明顯的形態(tài)破壞(圖4E)。
光學(xué)顯微鏡顯示，約30%-40%的HDAC2 KO結(jié)腸癌細(xì)胞在藥物治療后表現(xiàn)出焦亡形態(tài)（特征性細(xì)胞膜膨脹），而野生型細(xì)胞僅有3%-6%出現(xiàn)焦亡形態(tài)（圖4F）。然而，在HDAC2 KO系中通過siRNA介導(dǎo)敲低NLRP3可顯著降低焦亡細(xì)胞比例至10%以下（圖4G）。    研究進(jìn)行了Caspase-1和PI雙染。結(jié)果顯示，在HDAC2 KO后，瑞戈非尼或5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡水平增加，而在NLRP3敲低（siNLRP3）后，細(xì)胞焦亡水平降低（圖4H、I）?？傊?，結(jié)果確定了NLRP3是HDAC2的一個(gè)重要功能靶點(diǎn)，并證實(shí)HDAC2通過調(diào)節(jié)NLRP3水平來控制結(jié)直腸癌的藥理學(xué)細(xì)胞焦亡。   

 圖4：敲除HDAC2可通過上調(diào)NLRP3來激活gasdermin D(GSDMD)介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡5.HDAC2通過抑制染色質(zhì)可及性來阻斷p-P65對NLRP3的轉(zhuǎn)錄作用熱圖顯示，HDAC2沉默并未顯著改變SW620細(xì)胞中的整體染色質(zhì)可及性（圖5A）。對按HDAC2 KO后染色質(zhì)可及性變化排序的基因進(jìn)行GSEA。結(jié)果表明，焦亡途徑顯著富集，排名第一（圖5B）。染色質(zhì)可及性變化的可視化顯示開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)增強(qiáng)，特別是在NLRP3啟動子處，而其他焦亡基因GSDMD、Caspase-1和PYCARD的調(diào)控區(qū)沒有類似的影響（圖5C）。之前的研究表明，瑞格非尼通過抑制GSK3β（Ser9）自磷酸化而顯著增加p-P65（Ser536）的激活（圖5D）。在檢查NLRP3啟動子的DNA序列后，確定了轉(zhuǎn)錄因子P65的假定結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于NLRP3轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游?1086至?1077bp(GGGAATTTCC)處(5E)。隨后的ChIP測定表明，在HDAC2 KO或用HDAC2特異性抑制劑SCA治療后，轉(zhuǎn)錄因子pP65與NLRP3啟動子區(qū)域的結(jié)合增強(qiáng)(圖5F)。
Western blot分析顯示，用瑞戈非尼處理的HDAC2 KO細(xì)胞中NLRP3水平顯著增加(圖5G)。這些結(jié)果表明，HDAC2 KO提高了NLRP3啟動子處的染色質(zhì)可及性，從而允許在藥物誘導(dǎo)條件下募集更多的p-P65，促進(jìn)NLRP3轉(zhuǎn)錄激活。   

 圖5：HDAC2通過抑制染色質(zhì)可及性來阻斷p-P65對NLRP3的轉(zhuǎn)錄作用6.抑制HDAC2可促進(jìn)H3K27ac-BRD4-p-P65復(fù)合物的形成，從而激活NLRP3轉(zhuǎn)錄通過分析ChIP-seq數(shù)據(jù)集，與THP-1細(xì)胞和結(jié)腸隱窩細(xì)胞相比，CRC細(xì)胞中NLRP3啟動子區(qū)域內(nèi)的H3K27乙酰化水平明顯較低（圖6A）。ChIP表明，在HDAC2缺失后，NLRP3基因啟動子處的H3K27ac增加，但H3K9ac沒有增加（圖6B）。
Western blot分析表明，與對照相比，HDAC2 KO細(xì)胞中的H3K27ac水平增加，NLRP3表達(dá)也相應(yīng)增加（圖6C）。
熒光顯微鏡分析顯示，與野生型對照相比，瑞戈非尼治療后，HDAC2 KO細(xì)胞中的核H3K27乙酰化增加，并且HDAC2 KO細(xì)胞中的p-P65核募集增強(qiáng)（圖6D、E）。在細(xì)胞中進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，觀察到內(nèi)源性BRD4與P65和H3K27ac形成NLRP3復(fù)合物，在HDAC2 KO時(shí)該復(fù)合物得到增強(qiáng)（圖6F）。此外，使用p-P65抗體的ChIP表明，在HDAC2 KO CRC細(xì)胞中，BRD4 siRNA處理抑制后，NLRP3啟動子上的p-P65占有率降低（圖6G）。結(jié)果表明，HDAC2缺失增加了H3K27ac，促進(jìn)了H3K27ac-BRD4-p-P65復(fù)合物的形成，從而招募更多的p-P65并驅(qū)動NLRP3轉(zhuǎn)錄激活。 

 圖6：抑制HDAC2可促進(jìn)H3K27ac-BRD4-p-P65復(fù)合物的形成，從而激活NLRP3轉(zhuǎn)錄7.HDAC2與H3K27ac/p-P65/NLRP3相關(guān)，可預(yù)測預(yù)后并代表CRC的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)研究構(gòu)建CRC PDX 模型，使用蛋白質(zhì)印跡法分析腫瘤裂解物顯示，聯(lián)合治療組的Cleaved GSDMD升高，表明細(xì)胞焦亡，但兩種PDX模型的單藥組均未升高（圖7A、B）。與對照組相比，瑞戈非尼加SCA組的腫瘤大小顯著減小。然而，瑞戈非尼和SCA單獨(dú)使用均未在體內(nèi)顯著抑制腫瘤生長（圖7C、D）。在BP0036模型中，經(jīng)過相同藥物劑量治療12天后，瑞戈非尼加SCA組的腫瘤生長抑制率明顯高于單獨(dú)使用瑞戈非尼治療組（圖7E）。在SW620結(jié)腸癌異種移植中也得到驗(yàn)證，聯(lián)合治療比單一治療具有更佳的腫瘤抑制效果（圖7F-H）。通過免疫組織化學(xué)染色分析了82例CRC患者標(biāo)本中HDAC2、NLRP3、H3K27ac和pP65的表達(dá)水平，觀察到HDAC2的表達(dá)與p-P65、H3K27ac和NLRP3的水平呈負(fù)相關(guān)（圖7I）。Kaplan-Meier生存分析表明，HDAC2表達(dá)高的患者總體生存期較短（圖7J）。    

圖7：HDAC2與H3K27ac/p-P65/NLRP3相關(guān)，可預(yù)測預(yù)后并代表結(jié)直腸癌(CRC)的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)
文章小結(jié)本研究表明CRC中HDAC2的過度表達(dá)導(dǎo)致NLRP3的表觀遺傳抑制，阻礙藥物治療引起的細(xì)胞焦亡。抑制HDAC2有助于形成H3K27ac-BRD4-p-P65復(fù)合物，從而促進(jìn)NLRP3轉(zhuǎn)錄。這篇文章值得細(xì)細(xì)品味，除了“細(xì)胞焦亡”和“炎癥小體”國自然熱點(diǎn)，還有“乙?；焙汀邦惼鞴佟?，學(xué)會這篇文章的研究思路，分分鐘中標(biāo)~

主營項(xiàng)目

1. 動物實(shí)驗(yàn)

動物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動生化檢測等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

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