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單細(xì)胞測序技術(shù)能夠提供前所未有的細(xì)胞分辨率，揭示組織內(nèi)不同細(xì)胞類型之間的異質(zhì)性。其分析難點(diǎn)主要在于：如何從繁雜的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)線索，并通過分析和后續(xù)濕實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證該線索。

因此不僅需要了解該疾病的病理過程（研究方向，如有藥物還要了解藥理等信息）、疾病相關(guān)組織的病理特點(diǎn)和過程、參與某個病理過程的細(xì)胞群及其功能表型、調(diào)控細(xì)胞群表型的分子和機(jī)制等信息，還需要了解驗(yàn)證某個線索需要用到的分析方法、實(shí)驗(yàn)方法以及該方法的優(yōu)勢和局限性。

在擁有單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)后，如何有效地設(shè)計(jì)研究思路以最大化利用這些寶貴的信息呢？以下是一份基于單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)分析的研究設(shè)計(jì)方案。

研究策略

以特定細(xì)胞群為主要創(chuàng)新點(diǎn)的思路設(shè)計(jì)

對所有細(xì)胞進(jìn)行分群和注釋后，我們通常可以獲得幾個~十幾個細(xì)胞類群，各個細(xì)胞類群也可以進(jìn)一步細(xì)分為多個亞群。那么如何挑選目標(biāo)細(xì)胞類群呢？基于已發(fā)表的經(jīng)典文章可以歸納出以下策略。

01
特定細(xì)胞群的異質(zhì)性分析

如在免疫相關(guān)的單細(xì)胞研究中，T細(xì)胞等免疫細(xì)胞往往會被細(xì)分為多個細(xì)胞亞群，其中新的亞群可能起到關(guān)鍵作用，可作為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。

2024年發(fā)表于Nature 的泛癌單細(xì)胞研究表明[1]，新的T細(xì)胞亞群—干細(xì)胞樣CD4 T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖1 在小鼠癌癥模型中識別出TCF1+lin?干細(xì)胞樣CD4 T細(xì)胞群體

「 小結(jié) 」

在深入解析細(xì)胞亞群異質(zhì)性時，單細(xì)胞測序技術(shù)的分辨率直接影響亞群鑒定的精準(zhǔn)度。

10×單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（3'端）采用優(yōu)化標(biāo)記策略，穩(wěn)定捕獲低豐度轉(zhuǎn)錄本，尤其適合干細(xì)胞樣CD4 T細(xì)胞這類稀有亞群的基因表達(dá)圖譜構(gòu)建。

特有微流控分選系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)數(shù)千個細(xì)胞并行捕獲，配合分析流程亞群聚類算法，表達(dá)模式差異較小的細(xì)胞亞型也能有效區(qū)分，為發(fā)現(xiàn)治療新靶點(diǎn)提供可靠數(shù)據(jù)支撐。

三黍服務(wù)  

技術(shù)參數(shù)    

10×單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（3'）    100G    

02
疾病相關(guān)細(xì)胞群的研究

在發(fā)育分化、疾病進(jìn)程、免疫應(yīng)答等進(jìn)程中，特定細(xì)胞類型的相對比例改變可能反映出細(xì)胞分化過程的變化。此外，細(xì)胞比例變化也可以反映組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。在腫瘤研究中，不同細(xì)胞類型的比例變化可能與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等密切相關(guān)。可重點(diǎn)關(guān)注在疾病中比例中“顯著升高或者降低”的細(xì)胞群以及在疾病中功能相關(guān)的細(xì)胞群。

2.1 在疾病中比例“顯著升高或者降低”的細(xì)胞群

挑選在不同比較組間細(xì)胞比例發(fā)生顯著變化的細(xì)胞類型，這個細(xì)胞群在疾病組（或者干預(yù)組）比對照組（或者疾病組）的比例顯著升高和降低。

圖2 CAF亞群在多癌種中的細(xì)胞占比情況[2]

2.2 與疾病中功能相關(guān)的細(xì)胞群

如2024年發(fā)表在nature communications的文章中[3]，通過單細(xì)胞測序（主要技術(shù)）分析了CD（研究疾病類型）患者的末端回腸和升結(jié)腸細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了一種與CD相關(guān)的特殊上皮細(xì)胞類型“LND”（關(guān)鍵細(xì)胞群）能與免疫細(xì)胞相互作用，在CD活躍期中發(fā)揮作用。

圖3 與克羅恩病相關(guān)的特殊上皮細(xì)胞類型的鑒定和多模式表征

「 小結(jié) 」

疾病進(jìn)程中細(xì)胞比例的動態(tài)變化是反映病理機(jī)制的核心，當(dāng)研究聚焦于疾病相關(guān)細(xì)胞群體的功能解析時，多維度數(shù)據(jù)整合尤為重要。

針對疾病中顯著波動的細(xì)胞群體，10×單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（5'端）憑借其高分辨率的細(xì)胞分型能力，可準(zhǔn)確識別豐度發(fā)生顯著改變的細(xì)胞類型。

整合TCR/BCR分析模塊，能精準(zhǔn)量化不同細(xì)胞類型豐度差異，同步解析免疫細(xì)胞的克隆擴(kuò)增特征，揭示免疫細(xì)胞克隆動態(tài)演變，為解析細(xì)胞比例變化機(jī)制提供關(guān)鍵線索。

三黍服務(wù)    技術(shù)參數(shù)    

10×單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（5'，TCR/BCR）    100G+10G    

03
組間表達(dá)模式顯著變化的細(xì)胞類型

如2023年發(fā)表在nature communications的文章中[4]，為了識別 T2D 患者中可能失調(diào)的基因，對四種主要內(nèi)分泌細(xì)胞類型（α、β、δ 和 γ 細(xì)胞）的病例和對照組進(jìn)行了差異 ASE 分析，結(jié)果表明在2型糖尿病數(shù)據(jù)集中，DAESC用于識別胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞中患者和對照之間的幾種差異調(diào)節(jié)基因。

圖4 克胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞中 2 型糖尿病患者和對照組之間的差異 ASE

「 小結(jié) 」

基因表達(dá)的組間差異分析是揭示疾病機(jī)制的重要突破口，染色質(zhì)可及性分析為基因表達(dá)差異的調(diào)控根源研究提供了新的維度。

10×單細(xì)胞ATAC測序技術(shù)精準(zhǔn)繪制細(xì)胞類型特異的開放染色質(zhì)圖譜，幫助發(fā)現(xiàn)類似內(nèi)分泌細(xì)胞中差異ASE基因的上游調(diào)控機(jī)制，為疾病相關(guān)通路解析提供表觀遺傳學(xué)證據(jù)。

與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)互補(bǔ)，共同鎖定疾病關(guān)鍵調(diào)控元件，揭示疾病相關(guān)基因表達(dá)失調(diào)的深層原因。

三黍服務(wù)    技術(shù)參數(shù)    

10×單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（ATAC）    60G    

04
根據(jù)研究目的挑選目標(biāo)細(xì)胞類型

當(dāng)研究目標(biāo)較為清晰時，可以基于細(xì)胞注釋結(jié)果，挑選與研究目標(biāo)最相關(guān)的細(xì)胞類群進(jìn)行后續(xù)分析。

例如在2024年發(fā)表于Journal of clinical investagation的巨噬細(xì)胞亞群在心臟修復(fù)中的作用機(jī)制研究中[5]，巨噬細(xì)胞作為心臟主要免疫細(xì)胞，具有促炎和促修復(fù)的雙重功能，但其亞群的異質(zhì)性及作用機(jī)制尚不明確。新生兒心臟具有短暫再生能力，而出生后10天及成年后心臟喪失這一能力，巨噬細(xì)胞亞群的動態(tài)變化可能是關(guān)鍵因素。所以作者對巨噬細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞H3K27ac ChIP - seq和scRNA - seq，分析細(xì)胞亞型、功能異質(zhì)性及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和增強(qiáng)子，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，揭示其功能和命運(yùn)決定機(jī)制。

圖5 巨噬細(xì)胞亞群注釋和基因功能結(jié)果

「 小結(jié) 」

針對特定細(xì)胞類型的機(jī)制研究，定制化分析方案可顯著提升研究效率。當(dāng)研究目標(biāo)明確指向特定細(xì)胞類群時，精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)挖掘策略尤為關(guān)鍵。

單細(xì)胞測序高級分析服務(wù)支持個性化流程設(shè)計(jì)，定制從亞型鑒定到調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的全套解決方案，助力揭示細(xì)胞命運(yùn)決定的核心機(jī)制。

結(jié)合表觀遺傳與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)性解析細(xì)胞亞群功能異質(zhì)性及動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

三黍服務(wù)   

技術(shù)參數(shù)    

單細(xì)胞測序高級分析    個性化定制    

ChIP-Seq(植物/動物，轉(zhuǎn)錄因子)    9G    

ChIP-Seq(植物/動物，組蛋白修飾)    9G    

當(dāng)疾病相關(guān)的細(xì)胞群被篩選到以后，可以對該亞群與其他細(xì)胞亞群進(jìn)行差異基因分析，得到差異基因list后我們則知道該亞群上下調(diào)了哪些基因，能幫助我們解釋致病的機(jī)制或?qū)ふ抑虏〉陌悬c(diǎn)，當(dāng)然，這需要我們?nèi)ゲ樵兏鞣N基因的背景、功能。

接下來，可以進(jìn)行功能分析，以進(jìn)一步尋找致病機(jī)制或縮小差異基因的范圍?？梢詮募?xì)胞、通路、分子的維度出發(fā)。

細(xì)胞層面有軌跡分析細(xì)胞、相互作用分析等。軌跡分析可以判斷聚焦的細(xì)胞亞群的來源或去路，緊接著上面的例子，我們可以對各種細(xì)胞亞群進(jìn)行軌跡分析，看看細(xì)胞亞群的軌跡變化情況。

細(xì)胞相互作用分析可以聚焦感興趣的核心亞群，看哪些細(xì)胞與核心亞群作用變化明顯，可直接找到亞群甚至相互作用的表面蛋白。

通路層面則有GO，KEGG，GSEA，IPA等分析，對差異基因進(jìn)行富集，尋找與疾病相關(guān)的信號通路。

分子層面最基本的還是分析差異基因。

此外通過轉(zhuǎn)錄因子分析，SCENIC分析可以發(fā)現(xiàn)調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其本身也是蛋白（同樣有基因表達(dá)），我們可以進(jìn)一步縮小差異基因的范圍。

參考文獻(xiàn)

[1] Cardenas M A , Prokhnevska N , Sobierajska E ,et al.Author Correction: Differentiation fate of a stem-like CD4 T cell controls immunity to cancer[J]. Nature:1-1[2024-1119].DOI:10.1038/s41586-024-08303-1.

[2] Ma C, Yang C, Peng A,et al. Pan-cancer spatially resolved single-cell analysis reveals the crosstalk between cancer-associated fibroblasts and tumor microenvironment.[J]. Mol Cancer:[2023-08-13]. DOI: 10.1186/s12943-023-01876-x.

[3] Li J, Simmons AJ, Hawkins CV, Chiron S, et al. Identification and multimodal characterization of a specialized epithelial cell type associated with Crohn's disease[J].Nature Communications: [2024-08-22].DOI:10.1038/s41467-024-51580-7.

[4] Qi G , Strober B J , Popp J M ,et al.Single-cell allele-specific expression analysis reveals dynamic and cell-type-specific regulatory effects[J].Nature Communications, 2023, 14(1).DOI:10.1038/s41467-023-42016-9.

[5] Fu M , Jia S , Xu L ,et al.Single-cell multiomic analysis identifies macrophage subpopulations in promoting cardiac repair[J].Journal of Clinical Investigation, 2024, 134(19):20.DOI:10.1172/JCI175297 .

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主營項(xiàng)目

1. 動物實(shí)驗(yàn)

動物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動生化檢測等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

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