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一、細胞蛋白提取實驗步驟

1、細胞處理

①去除培養(yǎng)基
小心棄去六孔板中殘留的細胞培養(yǎng)基，確?？装鍍葻o多余液體，以避免干擾后續(xù)操作。

②PBS清洗
使用預冷的PBS溶液對細胞進行2 - 3次清洗，每次加入適量PBS后輕輕晃動孔板，使細胞充分浸潤。隨后，用濾紙輕輕吸干孔板底部的液體，注意避免過度吸干導致細胞損傷。PBS殘留過多會導致后續(xù)裂解液濃度稀釋，影響裂解效果。

③配制裂解液
在5毫升EP管中配制細胞裂解液。按100:1:1的體積比將RIPA強裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合均勻。在加入抑制劑時，將槍頭伸至液面以下，輕輕吹打混勻，確保各成分充分溶解并均勻分布，以防止抑制劑在液面上形成氣泡或分層。

④加入裂解液
向六孔板的每個孔中加入100 - 200微升配制好的RIPA裂解混合液。加入時，從高處逐滴加入，盡量使液體均勻鋪滿孔底，避免局部裂解液濃度過高或過低。隨后將孔板置于冰上靜置15分鐘，以促進細胞充分裂解。

⑤刮取細胞
使用細胞刮刀輕輕刮取細胞，每個孔刮1分鐘。先進行水平刮取，再進行斜向刮取，確保細胞完全從孔板表面脫落并匯集至孔底。刮取過程中動作要輕柔，避免過度刮取導致細胞碎片過多，影響后續(xù)蛋白提取的純度。

⑥收集細胞
將刮下的細胞懸液轉移至1.5毫升EP管中，置于冰上靜置10分鐘，使細胞進一步裂解，釋放出更多的蛋白成分。

2、蛋白提取與純化

①超聲處理
對收集好的細胞懸液進行超聲裂解處理。設置超聲儀參數(shù)為每次超聲5秒，間隔3秒，重復4次，功率為25%。超聲過程中需將樣品置于冰浴中，以防止蛋白因高溫變性。超聲處理可進一步破碎細胞，確保細胞內蛋白充分釋放。

②離心分離
將超聲處理后的細胞懸液在4℃條件下，以12000 - 14000轉/分鐘的速度離心15分鐘。離心完成后，小心取出EP管，將上清液轉移至新的EP管中，棄去沉淀。上清液中含有可溶性蛋白，是后續(xù)實驗的主要研究對象。

3、蛋白定量與處理

①測定蛋白濃度
從上清液中取2微升樣品，采用BCA法進行蛋白濃度測定。準確測量蛋白濃度是后續(xù)實驗（如SDS-PAGE、Western Blot等）的關鍵步驟，確保實驗結果的可靠性和可重復性。

②加入上樣緩沖液
按照4:1的體積比（蛋白上清液:loading buffer，此處loading buffer為5×）將loading buffer加入蛋白上清液中。例如，100微升蛋白上清液加入25微升loading buffer，充分混勻。上樣緩沖液含有還原劑和染料，可使蛋白在SDS-PAGE電泳中均勻分布并呈現(xiàn)條帶。

4、蛋白保存與后續(xù)處理

①熱處理
將加入上樣緩沖液后的蛋白樣品置于100℃水浴中煮沸10分鐘。煮沸過程中，蛋白會發(fā)生變性，使其在后續(xù)電泳中能夠充分展開并均勻分布。煮沸時需用重物壓住試管蓋，防止蒸汽彈開試管蓋。煮沸完成后，將試管置于桌面上進行離心，將冷凝在試管蓋內的液體離心至管底，再進行后續(xù)混勻操作，以確保樣品均質，保證實驗結果的可靠性。

②樣品保存
蛋白樣品易降解，反復凍融和熱處理后降解風險更高。因此，樣品提取后最好分裝保存。每次使用時僅溶解一管，用完即棄。在上樣前再進行熱處理效果更佳。樣品可置于-80℃冰箱中保存，以最大限度延長蛋白的穩(wěn)定性。

5、注意事項

①低溫操作：整個實驗過程應在低溫環(huán)境下進行，以減少蛋白降解的可能性。所有試劑和耗材均需提前置于冰上預冷。

②裂解液配制：配制裂解液時，需嚴格按照比例添加各成分，并確保充分混合均勻，以保證裂解效果。避免裂解液長時間暴露在空氣中，防止抑制劑失效。

③細胞刮?。汗稳〖毎麜r動作要輕柔，避免過度刮取導致細胞碎片過多，影響后續(xù)實驗結果。確保細胞完全脫落并匯集至孔底，避免殘留細胞影響蛋白提取效率。

④超聲處理：超聲時間不宜過長，以免過度破壞蛋白結構，影響后續(xù)分析。超聲過程中需密切觀察樣品狀態(tài)，避免產生過多泡沫。

⑤樣品保存：蛋白樣品分裝保存時，盡量減少分裝次數(shù)，避免反復凍融對蛋白造成損傷。每次取用時僅解凍一管，用完即棄，避免反復凍融。

⑥離心操作：離心時需確保離心機溫度設置為4℃，以保證蛋白在低溫環(huán)境下穩(wěn)定。離心完成后，小心操作，避免劇烈震蕩導致蛋白沉淀重新懸浮。

⑦蛋白濃度測定：在進行BCA法測定蛋白濃度時，需嚴格按照試劑盒說明書操作，確保標準曲線的準確性。樣品和標準品的體積需精確測量，以保證結果的可靠性。

6、常見問題及解決方法

①蛋白降解：如果發(fā)現(xiàn)蛋白樣品出現(xiàn)降解現(xiàn)象，可能是由于裂解液中抑制劑不足或樣品未在低溫環(huán)境下保存。建議增加抑制劑的用量，并嚴格控制實驗溫度。

②蛋白濃度測定不準確：如果蛋白濃度測定結果偏差較大，可能是由于標準曲線制備不準確或樣品處理不均勻。建議重新制備標準曲線，并在樣品處理過程中增加混勻步驟。

③超聲處理不充分：如果超聲處理后發(fā)現(xiàn)細胞裂解不完全，可能是由于超聲功率不足或超聲時間過短。建議適當增加超聲時間和功率，但需注意避免過度超聲導致蛋白變性

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