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一、細(xì)胞蛋白提取實(shí)驗(yàn)步驟

1、細(xì)胞處理

①去除培養(yǎng)基
小心棄去六孔板中殘留的細(xì)胞培養(yǎng)基，確?？装鍍?nèi)無(wú)多余液體，以避免干擾后續(xù)操作。

②PBS清洗
使用預(yù)冷的PBS溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2 - 3次清洗，每次加入適量PBS后輕輕晃動(dòng)孔板，使細(xì)胞充分浸潤(rùn)。隨后，用濾紙輕輕吸干孔板底部的液體，注意避免過(guò)度吸干導(dǎo)致細(xì)胞損傷。PBS殘留過(guò)多會(huì)導(dǎo)致后續(xù)裂解液濃度稀釋，影響裂解效果。

③配制裂解液
在5毫升EP管中配制細(xì)胞裂解液。按100:1:1的體積比將RIPA強(qiáng)裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合均勻。在加入抑制劑時(shí)，將槍頭伸至液面以下，輕輕吹打混勻，確保各成分充分溶解并均勻分布，以防止抑制劑在液面上形成氣泡或分層。

④加入裂解液
向六孔板的每個(gè)孔中加入100 - 200微升配制好的RIPA裂解混合液。加入時(shí)，從高處逐滴加入，盡量使液體均勻鋪滿孔底，避免局部裂解液濃度過(guò)高或過(guò)低。隨后將孔板置于冰上靜置15分鐘，以促進(jìn)細(xì)胞充分裂解。

⑤刮取細(xì)胞
使用細(xì)胞刮刀輕輕刮取細(xì)胞，每個(gè)孔刮1分鐘。先進(jìn)行水平刮取，再進(jìn)行斜向刮取，確保細(xì)胞完全從孔板表面脫落并匯集至孔底。刮取過(guò)程中動(dòng)作要輕柔，避免過(guò)度刮取導(dǎo)致細(xì)胞碎片過(guò)多，影響后續(xù)蛋白提取的純度。

⑥收集細(xì)胞
將刮下的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5毫升EP管中，置于冰上靜置10分鐘，使細(xì)胞進(jìn)一步裂解，釋放出更多的蛋白成分。

2、蛋白提取與純化

①超聲處理
對(duì)收集好的細(xì)胞懸液進(jìn)行超聲裂解處理。設(shè)置超聲儀參數(shù)為每次超聲5秒，間隔3秒，重復(fù)4次，功率為25%。超聲過(guò)程中需將樣品置于冰浴中，以防止蛋白因高溫變性。超聲處理可進(jìn)一步破碎細(xì)胞，確保細(xì)胞內(nèi)蛋白充分釋放。

②離心分離
將超聲處理后的細(xì)胞懸液在4℃條件下，以12000 - 14000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心15分鐘。離心完成后，小心取出EP管，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，棄去沉淀。上清液中含有可溶性蛋白，是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的主要研究對(duì)象。

3、蛋白定量與處理

①測(cè)定蛋白濃度
從上清液中取2微升樣品，采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。準(zhǔn)確測(cè)量蛋白濃度是后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如SDS-PAGE、Western Blot等）的關(guān)鍵步驟，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。

②加入上樣緩沖液
按照4:1的體積比（蛋白上清液:loading buffer，此處loading buffer為5×）將loading buffer加入蛋白上清液中。例如，100微升蛋白上清液加入25微升loading buffer，充分混勻。上樣緩沖液含有還原劑和染料，可使蛋白在SDS-PAGE電泳中均勻分布并呈現(xiàn)條帶。

4、蛋白保存與后續(xù)處理

①熱處理
將加入上樣緩沖液后的蛋白樣品置于100℃水浴中煮沸10分鐘。煮沸過(guò)程中，蛋白會(huì)發(fā)生變性，使其在后續(xù)電泳中能夠充分展開(kāi)并均勻分布。煮沸時(shí)需用重物壓住試管蓋，防止蒸汽彈開(kāi)試管蓋。煮沸完成后，將試管置于桌面上進(jìn)行離心，將冷凝在試管蓋內(nèi)的液體離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)混勻操作，以確保樣品均質(zhì)，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

②樣品保存
蛋白樣品易降解，反復(fù)凍融和熱處理后降解風(fēng)險(xiǎn)更高。因此，樣品提取后最好分裝保存。每次使用時(shí)僅溶解一管，用完即棄。在上樣前再進(jìn)行熱處理效果更佳。樣品可置于-80℃冰箱中保存，以最大限度延長(zhǎng)蛋白的穩(wěn)定性。

5、注意事項(xiàng)

①低溫操作：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在低溫環(huán)境下進(jìn)行，以減少蛋白降解的可能性。所有試劑和耗材均需提前置于冰上預(yù)冷。

②裂解液配制：配制裂解液時(shí)，需嚴(yán)格按照比例添加各成分，并確保充分混合均勻，以保證裂解效果。避免裂解液長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，防止抑制劑失效。

③細(xì)胞刮?。汗稳〖?xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免過(guò)度刮取導(dǎo)致細(xì)胞碎片過(guò)多，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。確保細(xì)胞完全脫落并匯集至孔底，避免殘留細(xì)胞影響蛋白提取效率。

④超聲處理：超聲時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以免過(guò)度破壞蛋白結(jié)構(gòu)，影響后續(xù)分析。超聲過(guò)程中需密切觀察樣品狀態(tài)，避免產(chǎn)生過(guò)多泡沫。

⑤樣品保存：蛋白樣品分裝保存時(shí)，盡量減少分裝次數(shù)，避免反復(fù)凍融對(duì)蛋白造成損傷。每次取用時(shí)僅解凍一管，用完即棄，避免反復(fù)凍融。

⑥離心操作：離心時(shí)需確保離心機(jī)溫度設(shè)置為4℃，以保證蛋白在低溫環(huán)境下穩(wěn)定。離心完成后，小心操作，避免劇烈震蕩導(dǎo)致蛋白沉淀重新懸浮。

⑦蛋白濃度測(cè)定：在進(jìn)行BCA法測(cè)定蛋白濃度時(shí)，需嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，確保標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的體積需精確測(cè)量，以保證結(jié)果的可靠性。

6、常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法

①蛋白降解：如果發(fā)現(xiàn)蛋白樣品出現(xiàn)降解現(xiàn)象，可能是由于裂解液中抑制劑不足或樣品未在低溫環(huán)境下保存。建議增加抑制劑的用量，并嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)溫度。

②蛋白濃度測(cè)定不準(zhǔn)確：如果蛋白濃度測(cè)定結(jié)果偏差較大，可能是由于標(biāo)準(zhǔn)曲線制備不準(zhǔn)確或樣品處理不均勻。建議重新制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在樣品處理過(guò)程中增加混勻步驟。

③超聲處理不充分：如果超聲處理后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞裂解不完全，可能是由于超聲功率不足或超聲時(shí)間過(guò)短。建議適當(dāng)增加超聲時(shí)間和功率，但需注意避免過(guò)度超聲導(dǎo)致蛋白變性

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主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書(shū)寫(xiě)作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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