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導(dǎo)語

流式細(xì)胞術(shù)（FCM）——作為跨越一整個(gè)世紀(jì)，經(jīng)過一代又一代科學(xué)家們不懈奮斗和努力下的結(jié)晶，現(xiàn)如今已經(jīng)成為探索生物細(xì)胞奧秘的關(guān)鍵技術(shù)。FCM 是在細(xì)胞流動(dòng)的狀態(tài)下，快速檢測(cè)細(xì)胞或顆粒物的熒光信號(hào)，從而判斷細(xì)胞的屬性及分化程度，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的定量分析和分選的技術(shù)。

由于 FCM 具有速度快、敏感性高、準(zhǔn)確性好、采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、方法靈活等優(yōu)點(diǎn)，在免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等不同研究領(lǐng)域和臨床診療中起著至關(guān)重要的作用。在這場(chǎng)歷史長(zhǎng)河中，諸多領(lǐng)域的科學(xué)家們共同見證了 FCM 從「無」到「有」的輝煌歷程。

那么，F(xiàn)CM 在感染性疾病、健康管理、自身免疫性疾病、血液疾病、腫瘤疾病、原發(fā)性免疫缺陷疾病等 6 大領(lǐng)域中如何應(yīng)用？讓我們?yōu)榇蠹乙灰唤议_它的神秘面紗。

一、披荊斬棘的「前世」——第一臺(tái)熒光細(xì)胞檢測(cè)儀的誕生

1934 年，Moldaven 是世界上最早提出使細(xì)胞檢測(cè)自動(dòng)化的人，他試圖用光電儀記錄流過 1 根毛細(xì)管的細(xì)胞數(shù)量，實(shí)現(xiàn)了從靜止細(xì)胞到流動(dòng)細(xì)胞的微觀計(jì)數(shù)[1]。隨后，流式細(xì)胞術(shù)在 1936 年至 1950 年間，經(jīng)歷了一段艱難的發(fā)展史（圖 1）。

1953 年，Parker 和 Hutcheon 研究出一種全血細(xì)胞計(jì)數(shù)器裝置，成為流式細(xì)胞儀的雛形[2]。

1969 年，在 Van Dilla Fulwyler 及其同事們的不懈努力下， 第一臺(tái)熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)器問世。在科學(xué)家們的不斷試驗(yàn)與改進(jìn)下，開創(chuàng)了細(xì)胞免疫熒光染色和檢測(cè)技術(shù)的新紀(jì)元。

1973 年，BD 公司與美國(guó)斯坦福大學(xué)合作，研制并生產(chǎn)了世界第一臺(tái)商用流式細(xì)胞儀 FACS I。自此，F(xiàn)CM 進(jìn)入飛速發(fā)展的新時(shí)代。

圖 1 流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展史

二、蓬勃發(fā)展的「今生」——從人工手動(dòng)到智能自動(dòng)的華麗蛻變

自 20 世紀(jì) 80 年代以來，F(xiàn)CM 得到了迅速的發(fā)展。它從一個(gè)只有 Fulwyler, M. J. 等幾名專家發(fā)展和使用的技術(shù)平臺(tái)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)通用的實(shí)驗(yàn)室工具和臨床診斷系統(tǒng)。近 20 年來，F(xiàn)CM 逐步完成從人工手動(dòng)到全自動(dòng)化流水線的蛻變，成長(zhǎng)為一項(xiàng)為患者不斷謀求福祉的強(qiáng)大技術(shù)。

目前，F(xiàn)CM 已逐漸朝著標(biāo)準(zhǔn)化的方向發(fā)展，同一樣本即使在不同實(shí)驗(yàn)室、不同操作人員、不同儀器上檢測(cè)結(jié)果也能保持完全一致，大大地為患者節(jié)省了重復(fù)檢測(cè)的時(shí)間和費(fèi)用。

此外，為了提高整體疾病的診療水平，F(xiàn)CM 朝著方案互聯(lián)的方向發(fā)展，不同儀器間的方案可以直接復(fù)制，讓走在前沿的診療方案快速推廣到各級(jí)醫(yī)院，為加快區(qū)域醫(yī)療中心建設(shè)以及醫(yī)聯(lián)體 / 醫(yī)共體的建立做出了巨大的貢獻(xiàn)！

三、立足當(dāng)下，展望未來——FCM 在六大領(lǐng)域中的應(yīng)用

（一）FCM 在感染性疾病中的應(yīng)用

1. 利用 FCM 檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面的 CD64（nCD64）水平的意義

1）nCD64 可作為細(xì)菌感染的早期診斷指標(biāo)：當(dāng)機(jī)體受到感染時(shí)，nCD64 可在感染發(fā)生的 3～6 h 大量表達(dá)，發(fā)揮抗感染作用（圖 2）。nCD64 在診斷細(xì)菌感染方面具有較高的敏感性和特異性，遠(yuǎn)優(yōu)于 CRP 和 WBC 計(jì)數(shù)[3]。

(2）nCD64 指數(shù)有助于結(jié)核病的診斷和預(yù)后（圖 3）：一項(xiàng)納入 189 例活動(dòng)性結(jié)核患者的研究顯示，nCD64 指數(shù)診斷結(jié)核性腦膜炎（TBM）的敏感性和特異性分別為 53.85% 和 100%。且 nCD64 指數(shù)可隨著患者病情的改善出現(xiàn)下降，并在治療后 4 周顯著下降[4]。

2. FCM 檢測(cè)單核細(xì)胞人類白細(xì)胞抗原-DR（mHLA-DR）有助于膿毒癥的診斷及預(yù)后評(píng)估

與健康人群相比，膿毒癥患者外周 mHLA-DR 顯著降低，膿毒癥第 3～4 日后患者 mHLA-DR 的快速恢復(fù)提示患者具有良好的臨床預(yù)后。反之，mHLA-DR 持續(xù)降低往往與不良臨床結(jié)局相關(guān)，如死亡、繼發(fā)性感染等[5]。

3. FCM 在新冠感染中的應(yīng)用

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院王福生院士團(tuán)隊(duì)發(fā)布在《柳葉刀呼吸醫(yī)學(xué)》[6]上的全世界首例新冠病毒感染病理解剖報(bào)告中揭示，患者外周血 CD4+ 和 CD8+ T 細(xì)胞數(shù)量大幅減少，但其狀態(tài)卻表現(xiàn)為過度激活。

淋巴細(xì)胞減少是新冠感染患者的共同特征（圖 4），并可能是與疾病嚴(yán)重程度和死亡率相關(guān)的重要因素。利用 FCM 進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群（TBNK）檢測(cè)，在新冠感染早期及時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者免疫功能變化、判斷病情發(fā)展，可以為疾病的轉(zhuǎn)歸和治療提供指導(dǎo)作用。

（二）FCM 在健康管理中的作用

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科副主任汪峰教授曾指出：「免疫力檢測(cè)聯(lián)合常規(guī)檢查能夠更精準(zhǔn)地發(fā)現(xiàn)亞健康狀態(tài)，提示疾病風(fēng)險(xiǎn)」。TBNK 分析正是進(jìn)行免疫力檢測(cè)的重要手段，利用 FCM 進(jìn)行 TBNK 計(jì)數(shù)分析，對(duì)機(jī)體的免疫狀態(tài)進(jìn)行精準(zhǔn)評(píng)估，篩查免疫力低下的高風(fēng)險(xiǎn)人群，做到疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。

新冠病毒可破壞人體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的直接損傷、分化障礙、誘導(dǎo)凋亡等。中華醫(yī)學(xué)會(huì)健康管理學(xué)分會(huì) 2023 年《新型冠狀病毒感染康復(fù)期人群健康體檢特殊項(xiàng)目的專家共識(shí)》[8]提出：針對(duì)「陽康」后 3 個(gè)月內(nèi)的人群，建議進(jìn)行 TBNK 分析，從而評(píng)估機(jī)體免疫功能的恢復(fù)狀況，發(fā)現(xiàn)異常狀態(tài)后及時(shí)采取措施。

（三）FCM 在自身免疫性疾病中的應(yīng)用

自身免疫性疾病的疾病活動(dòng)主要與漿母細(xì)胞及短壽漿細(xì)胞分泌的抗體有關(guān)。應(yīng)用 FCM 對(duì)患者外周血中漿細(xì)胞及細(xì)胞表面免疫標(biāo)志進(jìn)行分析，對(duì)疾病的診斷、預(yù)后判斷和治療監(jiān)測(cè)都有一定的意義。

1. 外周血漿母細(xì)胞水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）疾病活動(dòng)度的變化呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，是判斷 SLE 疾病活動(dòng)度、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的敏感指標(biāo)。

2. 預(yù)測(cè)、評(píng)估 B 細(xì)胞靶向藥物療效，預(yù)防疾病復(fù)發(fā)：應(yīng)用利妥昔單抗治療 6 個(gè)月后，檢測(cè)漿母細(xì)胞水平 > 0.0008 × 109/L 的患者，在接下來的 26 周和 52 周內(nèi)的復(fù)發(fā)率分別為 90% 和 100%（圖 5）。因此，監(jiān)測(cè)漿母細(xì)胞水平，可為疾病復(fù)發(fā)預(yù)警[9]。

圖 5 在 6 個(gè)月時(shí)檢測(cè)到血漿母細(xì)胞 > 0.0008 × 109/L，預(yù)示著更早的復(fù)發(fā)

（四）FCM 在血液疾病中的應(yīng)用

FCM 通過對(duì)外周血細(xì)胞或骨髓細(xì)胞表面抗原和 DNA 的檢測(cè)分析，在各種血液病的診斷、預(yù)后判斷和治療中具有舉足輕重的地位。

1. 血液病免疫分型：2017 年《流式細(xì)胞學(xué)在非霍奇金淋巴瘤診斷中的應(yīng)用專家共識(shí)》[10]指出，利用 FCM 對(duì)淋巴瘤進(jìn)行免疫表型分析，可以實(shí)現(xiàn)白血病的診斷和治療。其中，有些淋巴瘤可以用 FCM 明確診斷，主要包括急 / 慢性淋巴細(xì)胞白血病、毛細(xì)胞白血病、漿細(xì)胞腫瘤、T 大顆粒淋巴細(xì)胞白血病等。

2. 微小殘留病變（MRD）監(jiān)測(cè)：用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（MP-FCM）進(jìn)行惡性血液病 MRD 監(jiān)測(cè)，具有敏感性高、特異性好、適用范圍廣等優(yōu)勢(shì)（圖 6）。2017 年《多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)急性白血病及漿細(xì)胞腫瘤微小殘留病中國(guó)專家共識(shí)》表示，目前已成為惡性血液病臨床療效觀察和預(yù)后分層的重要依據(jù)[11]。

3. FCM 對(duì)其他種類血液病的診斷和治療監(jiān)測(cè)：如陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿。FCM 采用熒光標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)血細(xì)胞 CD59 的表達(dá)做定量分析，輔助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴(yán)重程度。

（五）FCM 在腫瘤診斷中的應(yīng)用

TBNK 分析在調(diào)節(jié)免疫和特異性殺傷腫瘤細(xì)胞方面起著至關(guān)重要的作用。利用 FCM 進(jìn)行 TBNK 分析，可精準(zhǔn)評(píng)估腫瘤患者的免疫狀態(tài)，有助于早期診斷惡性腫瘤，進(jìn)而為患者后續(xù)的治療提供指導(dǎo)和依據(jù)[12]，主要包括：

1. TBNK 監(jiān)測(cè)可反映腫瘤患者免疫狀態(tài)：有研究顯示，非小細(xì)胞肺癌患者的淋巴細(xì)胞增殖能力明顯受損，各亞群細(xì)胞數(shù)量絕對(duì)減少，且 CD4+ T 淋巴細(xì)胞減少的患者總生存期低于 CD4+ T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù) > 500/uL 的患者（圖 7）[13,14]。

2. T 細(xì)胞精細(xì)分型可在早期預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生：研究表明，CD4+ T 細(xì)胞計(jì)數(shù)和 CD8+ HLA-DR/CD8+ 和 CD8+ CD38+/CD8+ T 細(xì)胞百分比與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，是預(yù)測(cè)腫瘤進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物（圖 8）[15]。

（六）FCM 在原發(fā)性免疫缺陷病中的應(yīng)用

原發(fā)性免疫缺陷?。≒ID）是遺傳因素或先天性免疫系統(tǒng)發(fā)育不良造成免疫功能障礙而引起的疾病，多在兒童階段發(fā)病。通過 FCM 開展免疫功能評(píng)估，在重點(diǎn)人群中早期發(fā)現(xiàn)和治療 PID 患者，可顯著提高患者的存活率，減少致殘率和臨床不良事件，提高患者生命質(zhì)量。

1. 用 FCM 檢測(cè) PID 相關(guān)蛋白及功能：某些 PID 可通過 FCM 檢測(cè)特定蛋白及其功能，快速篩選或確診，如 X 連鎖無丙種球蛋白血癥（XLA）、X 連鎖高 IgM 綜合征（XHIM）等[16]。

2. 對(duì)新生兒重癥聯(lián)合免疫缺陷?。⊿CID）進(jìn)行篩查：目前已發(fā)現(xiàn)的 10 余種 SCID 致病基因共同特征為功能性 T 細(xì)胞完全缺如或顯著減少。因此，定量分析 T 細(xì)胞受體剪切環(huán)（TREC）進(jìn)行初篩后，陽性和可疑患者可利用 FCM 進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量檢測(cè)，以便進(jìn)一步確診和排除疑似病例。

3. FCM 評(píng)估接種疫苗前兒童的免疫功能：由于免疫系統(tǒng)缺陷，PID 患者接種部分減毒活疫苗后無法激活免疫防護(hù)，反而導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng)甚至死亡[17]。在免疫接種過程中，利用 FCM 對(duì)接種兒童的免疫功能進(jìn)行判斷和評(píng)估，可有效避免接種不適疫苗造成的感染和死亡。

小結(jié)

經(jīng)過一個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展之路，集多個(gè)學(xué)科的知識(shí)與智慧于一身的 FCM，具有快速、靈敏及能同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)分析等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中必不可少的監(jiān)測(cè)技術(shù)手段。FCM 的應(yīng)用涵蓋基礎(chǔ)研究到臨床實(shí)踐中的各個(gè)方面，可對(duì)不同學(xué)科的建設(shè)與發(fā)展起到重要作用。同時(shí)，可參與感染、健康管理、風(fēng)濕、血液、腫瘤、兒科等多個(gè)學(xué)科的疾病診斷、微小殘留病變監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估，為臨床診療提供極大的幫助和便利。

如有需要，請(qǐng)聯(lián)系我們~

主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。

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