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導(dǎo)語

流式細胞術(shù)（FCM）——作為跨越一整個世紀(jì)，經(jīng)過一代又一代科學(xué)家們不懈奮斗和努力下的結(jié)晶，現(xiàn)如今已經(jīng)成為探索生物細胞奧秘的關(guān)鍵技術(shù)。FCM 是在細胞流動的狀態(tài)下，快速檢測細胞或顆粒物的熒光信號，從而判斷細胞的屬性及分化程度，實現(xiàn)細胞的定量分析和分選的技術(shù)。

由于 FCM 具有速度快、敏感性高、準(zhǔn)確性好、采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、方法靈活等優(yōu)點，在免疫學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)等不同研究領(lǐng)域和臨床診療中起著至關(guān)重要的作用。在這場歷史長河中，諸多領(lǐng)域的科學(xué)家們共同見證了 FCM 從「無」到「有」的輝煌歷程。

那么，F(xiàn)CM 在感染性疾病、健康管理、自身免疫性疾病、血液疾病、腫瘤疾病、原發(fā)性免疫缺陷疾病等 6 大領(lǐng)域中如何應(yīng)用？讓我們?yōu)榇蠹乙灰唤议_它的神秘面紗。

一、披荊斬棘的「前世」——第一臺熒光細胞檢測儀的誕生

1934 年，Moldaven 是世界上最早提出使細胞檢測自動化的人，他試圖用光電儀記錄流過 1 根毛細管的細胞數(shù)量，實現(xiàn)了從靜止細胞到流動細胞的微觀計數(shù)[1]。隨后，流式細胞術(shù)在 1936 年至 1950 年間，經(jīng)歷了一段艱難的發(fā)展史（圖 1）。

1953 年，Parker 和 Hutcheon 研究出一種全血細胞計數(shù)器裝置，成為流式細胞儀的雛形[2]。

1969 年，在 Van Dilla Fulwyler 及其同事們的不懈努力下， 第一臺熒光檢測細胞計數(shù)器問世。在科學(xué)家們的不斷試驗與改進下，開創(chuàng)了細胞免疫熒光染色和檢測技術(shù)的新紀(jì)元。

1973 年，BD 公司與美國斯坦福大學(xué)合作，研制并生產(chǎn)了世界第一臺商用流式細胞儀 FACS I。自此，F(xiàn)CM 進入飛速發(fā)展的新時代。

圖 1 流式細胞術(shù)的發(fā)展史

二、蓬勃發(fā)展的「今生」——從人工手動到智能自動的華麗蛻變

自 20 世紀(jì) 80 年代以來，F(xiàn)CM 得到了迅速的發(fā)展。它從一個只有 Fulwyler, M. J. 等幾名專家發(fā)展和使用的技術(shù)平臺轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€通用的實驗室工具和臨床診斷系統(tǒng)。近 20 年來，F(xiàn)CM 逐步完成從人工手動到全自動化流水線的蛻變，成長為一項為患者不斷謀求福祉的強大技術(shù)。

目前，F(xiàn)CM 已逐漸朝著標(biāo)準(zhǔn)化的方向發(fā)展，同一樣本即使在不同實驗室、不同操作人員、不同儀器上檢測結(jié)果也能保持完全一致，大大地為患者節(jié)省了重復(fù)檢測的時間和費用。

此外，為了提高整體疾病的診療水平，F(xiàn)CM 朝著方案互聯(lián)的方向發(fā)展，不同儀器間的方案可以直接復(fù)制，讓走在前沿的診療方案快速推廣到各級醫(yī)院，為加快區(qū)域醫(yī)療中心建設(shè)以及醫(yī)聯(lián)體 / 醫(yī)共體的建立做出了巨大的貢獻！

三、立足當(dāng)下，展望未來——FCM 在六大領(lǐng)域中的應(yīng)用

（一）FCM 在感染性疾病中的應(yīng)用

1. 利用 FCM 檢測中性粒細胞表面的 CD64（nCD64）水平的意義

1）nCD64 可作為細菌感染的早期診斷指標(biāo)：當(dāng)機體受到感染時，nCD64 可在感染發(fā)生的 3～6 h 大量表達，發(fā)揮抗感染作用（圖 2）。nCD64 在診斷細菌感染方面具有較高的敏感性和特異性，遠優(yōu)于 CRP 和 WBC 計數(shù)[3]。

(2）nCD64 指數(shù)有助于結(jié)核病的診斷和預(yù)后（圖 3）：一項納入 189 例活動性結(jié)核患者的研究顯示，nCD64 指數(shù)診斷結(jié)核性腦膜炎（TBM）的敏感性和特異性分別為 53.85% 和 100%。且 nCD64 指數(shù)可隨著患者病情的改善出現(xiàn)下降，并在治療后 4 周顯著下降[4]。

2. FCM 檢測單核細胞人類白細胞抗原-DR（mHLA-DR）有助于膿毒癥的診斷及預(yù)后評估

與健康人群相比，膿毒癥患者外周 mHLA-DR 顯著降低，膿毒癥第 3～4 日后患者 mHLA-DR 的快速恢復(fù)提示患者具有良好的臨床預(yù)后。反之，mHLA-DR 持續(xù)降低往往與不良臨床結(jié)局相關(guān)，如死亡、繼發(fā)性感染等[5]。

3. FCM 在新冠感染中的應(yīng)用

中國人民解放軍總醫(yī)院王福生院士團隊發(fā)布在《柳葉刀呼吸醫(yī)學(xué)》[6]上的全世界首例新冠病毒感染病理解剖報告中揭示，患者外周血 CD4+ 和 CD8+ T 細胞數(shù)量大幅減少，但其狀態(tài)卻表現(xiàn)為過度激活。

淋巴細胞減少是新冠感染患者的共同特征（圖 4），并可能是與疾病嚴重程度和死亡率相關(guān)的重要因素。利用 FCM 進行外周血淋巴細胞亞群（TBNK）檢測，在新冠感染早期及時動態(tài)監(jiān)測患者免疫功能變化、判斷病情發(fā)展，可以為疾病的轉(zhuǎn)歸和治療提供指導(dǎo)作用。

（二）FCM 在健康管理中的作用

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院檢驗科副主任汪峰教授曾指出：「免疫力檢測聯(lián)合常規(guī)檢查能夠更精準(zhǔn)地發(fā)現(xiàn)亞健康狀態(tài)，提示疾病風(fēng)險」。TBNK 分析正是進行免疫力檢測的重要手段，利用 FCM 進行 TBNK 計數(shù)分析，對機體的免疫狀態(tài)進行精準(zhǔn)評估，篩查免疫力低下的高風(fēng)險人群，做到疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。

新冠病毒可破壞人體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致淋巴細胞的直接損傷、分化障礙、誘導(dǎo)凋亡等。中華醫(yī)學(xué)會健康管理學(xué)分會 2023 年《新型冠狀病毒感染康復(fù)期人群健康體檢特殊項目的專家共識》[8]提出：針對「陽康」后 3 個月內(nèi)的人群，建議進行 TBNK 分析，從而評估機體免疫功能的恢復(fù)狀況，發(fā)現(xiàn)異常狀態(tài)后及時采取措施。

（三）FCM 在自身免疫性疾病中的應(yīng)用

自身免疫性疾病的疾病活動主要與漿母細胞及短壽漿細胞分泌的抗體有關(guān)。應(yīng)用 FCM 對患者外周血中漿細胞及細胞表面免疫標(biāo)志進行分析，對疾病的診斷、預(yù)后判斷和治療監(jiān)測都有一定的意義。

1. 外周血漿母細胞水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）疾病活動度的變化呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，是判斷 SLE 疾病活動度、預(yù)測復(fù)發(fā)的敏感指標(biāo)。

2. 預(yù)測、評估 B 細胞靶向藥物療效，預(yù)防疾病復(fù)發(fā)：應(yīng)用利妥昔單抗治療 6 個月后，檢測漿母細胞水平 > 0.0008 × 109/L 的患者，在接下來的 26 周和 52 周內(nèi)的復(fù)發(fā)率分別為 90% 和 100%（圖 5）。因此，監(jiān)測漿母細胞水平，可為疾病復(fù)發(fā)預(yù)警[9]。

圖 5 在 6 個月時檢測到血漿母細胞 > 0.0008 × 109/L，預(yù)示著更早的復(fù)發(fā)

（四）FCM 在血液疾病中的應(yīng)用

FCM 通過對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和 DNA 的檢測分析，在各種血液病的診斷、預(yù)后判斷和治療中具有舉足輕重的地位。

1. 血液病免疫分型：2017 年《流式細胞學(xué)在非霍奇金淋巴瘤診斷中的應(yīng)用專家共識》[10]指出，利用 FCM 對淋巴瘤進行免疫表型分析，可以實現(xiàn)白血病的診斷和治療。其中，有些淋巴瘤可以用 FCM 明確診斷，主要包括急 / 慢性淋巴細胞白血病、毛細胞白血病、漿細胞腫瘤、T 大顆粒淋巴細胞白血病等。

2. 微小殘留病變（MRD）監(jiān)測：用多參數(shù)流式細胞術(shù)（MP-FCM）進行惡性血液病 MRD 監(jiān)測，具有敏感性高、特異性好、適用范圍廣等優(yōu)勢（圖 6）。2017 年《多參數(shù)流式細胞術(shù)檢測急性白血病及漿細胞腫瘤微小殘留病中國專家共識》表示，目前已成為惡性血液病臨床療效觀察和預(yù)后分層的重要依據(jù)[11]。

3. FCM 對其他種類血液病的診斷和治療監(jiān)測：如陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿。FCM 采用熒光標(biāo)記的單克隆抗體對血細胞 CD59 的表達做定量分析，輔助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴重程度。

（五）FCM 在腫瘤診斷中的應(yīng)用

TBNK 分析在調(diào)節(jié)免疫和特異性殺傷腫瘤細胞方面起著至關(guān)重要的作用。利用 FCM 進行 TBNK 分析，可精準(zhǔn)評估腫瘤患者的免疫狀態(tài)，有助于早期診斷惡性腫瘤，進而為患者后續(xù)的治療提供指導(dǎo)和依據(jù)[12]，主要包括：

1. TBNK 監(jiān)測可反映腫瘤患者免疫狀態(tài)：有研究顯示，非小細胞肺癌患者的淋巴細胞增殖能力明顯受損，各亞群細胞數(shù)量絕對減少，且 CD4+ T 淋巴細胞減少的患者總生存期低于 CD4+ T 淋巴細胞計數(shù) > 500/uL 的患者（圖 7）[13,14]。

2. T 細胞精細分型可在早期預(yù)測腫瘤發(fā)生：研究表明，CD4+ T 細胞計數(shù)和 CD8+ HLA-DR/CD8+ 和 CD8+ CD38+/CD8+ T 細胞百分比與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，是預(yù)測腫瘤進展的潛在生物標(biāo)志物（圖 8）[15]。

（六）FCM 在原發(fā)性免疫缺陷病中的應(yīng)用

原發(fā)性免疫缺陷?。≒ID）是遺傳因素或先天性免疫系統(tǒng)發(fā)育不良造成免疫功能障礙而引起的疾病，多在兒童階段發(fā)病。通過 FCM 開展免疫功能評估，在重點人群中早期發(fā)現(xiàn)和治療 PID 患者，可顯著提高患者的存活率，減少致殘率和臨床不良事件，提高患者生命質(zhì)量。

1. 用 FCM 檢測 PID 相關(guān)蛋白及功能：某些 PID 可通過 FCM 檢測特定蛋白及其功能，快速篩選或確診，如 X 連鎖無丙種球蛋白血癥（XLA）、X 連鎖高 IgM 綜合征（XHIM）等[16]。

2. 對新生兒重癥聯(lián)合免疫缺陷?。⊿CID）進行篩查：目前已發(fā)現(xiàn)的 10 余種 SCID 致病基因共同特征為功能性 T 細胞完全缺如或顯著減少。因此，定量分析 T 細胞受體剪切環(huán)（TREC）進行初篩后，陽性和可疑患者可利用 FCM 進行淋巴細胞亞群數(shù)量檢測，以便進一步確診和排除疑似病例。

3. FCM 評估接種疫苗前兒童的免疫功能：由于免疫系統(tǒng)缺陷，PID 患者接種部分減毒活疫苗后無法激活免疫防護，反而導(dǎo)致嚴重不良反應(yīng)甚至死亡[17]。在免疫接種過程中，利用 FCM 對接種兒童的免疫功能進行判斷和評估，可有效避免接種不適疫苗造成的感染和死亡。

小結(jié)

經(jīng)過一個多世紀(jì)的發(fā)展之路，集多個學(xué)科的知識與智慧于一身的 FCM，具有快速、靈敏及能同時進行多參數(shù)分析等優(yōu)點，已逐漸成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中必不可少的監(jiān)測技術(shù)手段。FCM 的應(yīng)用涵蓋基礎(chǔ)研究到臨床實踐中的各個方面，可對不同學(xué)科的建設(shè)與發(fā)展起到重要作用。同時，可參與感染、健康管理、風(fēng)濕、血液、腫瘤、兒科等多個學(xué)科的疾病診斷、微小殘留病變監(jiān)測和預(yù)后評估，為臨床診療提供極大的幫助和便利。

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