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熒光定量PCR（qPCR）是一種在標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上演變而成的技術(shù)，主要用于定量樣本中的DNA或RNA。它通過監(jiān)測每個PCR循環(huán)中擴增產(chǎn)物的量，實現(xiàn)對靶點起始量的精確測定。本文將深入探討熒光定量PCR中的關(guān)鍵曲線，包括擴增曲線、熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 qPCR擴增程序

熒光定量PCR的擴增程序分為擴增反應(yīng)階段和熔解反應(yīng)階段。

1.擴增反應(yīng)階段

擴增反應(yīng)階段采用兩步法，即每個循環(huán)結(jié)束后，即刻檢測熒光信號。這種實時監(jiān)測方式使得qPCR能夠動態(tài)地捕捉擴增過程中的熒光信號變化，進(jìn)而生成擴增曲線。擴增曲線反映了靶標(biāo)DNA片段的指數(shù)擴增階段，曲線上的熒光強度隨PCR循環(huán)數(shù)的增加而呈指數(shù)增長。該曲線的斜率（或Ct值）與起始模板的量呈負(fù)相關(guān)，可以準(zhǔn)確地定量目標(biāo)基因的表達(dá)水平。

2.熔解反應(yīng)階段

在擴增反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)置熔解反應(yīng)程序，使雙鏈DNA產(chǎn)物逐步解鏈，并檢測熒光信號的變化。不同序列的DNA片段在不同的溫度下解鏈，熔解曲線呈現(xiàn)出峰值，峰值溫度可以用于判斷擴增產(chǎn)物的特異性。如果存在非特異性擴增產(chǎn)物，熔解曲線會表現(xiàn)出多峰現(xiàn)象，從而提示可能存在雜交帶或其他非目標(biāo)序列的擴增。

 擴增曲線 

在PCR反應(yīng)過程中，熒光信號的強度隨著循環(huán)次數(shù)的增加而增加。擴增曲線顯示了熒光信號隨時間的變化，通常在Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）處會有明顯的信號上升，表示目標(biāo)DNA的擴增開始。理想情況下，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，導(dǎo)致曲線呈典型的“S”形。然而，實際反應(yīng)過程中，多種因素會影響擴增效率，例如酶活性降低、底物耗盡以及產(chǎn)物抑制等，最終導(dǎo)致曲線從指數(shù)期過渡到平臺期。

擴增曲線的三個階段

1.熒光背景信號階段（基線期）：

在這個階段，熒光信號的強度非常低，幾乎沒有顯著變化。此時，PCR反應(yīng)中的熒光信號主要來自于背景噪聲。

熒光信號指數(shù)擴增階段（對數(shù)期）：

隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，目標(biāo)DNA的數(shù)量開始迅速增加，熒光信號也隨之上升。此階段的熒光信號呈指數(shù)級增長，通常是數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵部分，因為在此階段可以準(zhǔn)確測定Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）。

平臺期（擴增產(chǎn)物不再呈指數(shù)級增加）：

當(dāng)PCR反應(yīng)接近完成時，擴增產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到飽和，熒光信號的增加速度減緩，最終趨于平穩(wěn)。這一階段的信號變化較小，通常不用于定量分析。

通過分析擴增曲線，可以評估PCR反應(yīng)的效率和特異性，并推斷樣本中目標(biāo)DNA的初始量，為后續(xù)的定量分析提供依據(jù)。

擴增曲線示意圖

在擴增曲線中這幾個專業(yè)術(shù)語了解一下：

基線：是指在PCR擴增初期，熒光信號未顯著增加的階段，通常用于確定Ct值的起始點。基線設(shè)置在擴增曲線的平緩部分，通常為PCR的最初3至15個循環(huán)；可自動生成或手動設(shè)置，設(shè)置時需確保消除熒光背景的同時，不覆蓋非熒光背景的擴增信號。

閾值：是在擴增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)，選擇的熒光檢出界限。閾值應(yīng)位于曲線的指數(shù)期中間，通常設(shè)置為基線熒光值標(biāo)準(zhǔn)差的10倍。對于不同基因的擴增，可以單獨設(shè)置閾值，但同一個基因的擴增必須保持相同的閾值。

Ct值（Cycle threshold）：是指在熒光PCR擴增過程中，當(dāng)擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的擴增循環(huán)次數(shù)。Ct值與模板的拷貝數(shù)存在著線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。Ct值通常取15至35之間的值，過大或過小都會影響定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.優(yōu)良的擴增曲線的特點

清晰的基線期：在熒光背景信號階段，曲線保持平穩(wěn)，未出現(xiàn)明顯的熒光信號升高。指數(shù)擴增階段：在對數(shù)期，曲線呈現(xiàn)出陡峭的上升趨勢，顯示出熒光信號的快速增加，表明PCR產(chǎn)物在有效擴增。平臺期：在擴增產(chǎn)物達(dá)到飽和后，曲線應(yīng)趨于平穩(wěn)，表示擴增不再呈指數(shù)級增加。

擴增效率：理想的擴增效率應(yīng)在90%-110%之間，確保每個循環(huán)中DNA的有效倍增。

無非特異性擴增：擴增曲線應(yīng)無多余的條帶或信號，確保特異性擴增目標(biāo)序列。

一致的重復(fù)性：在重復(fù)實驗中，擴增曲線應(yīng)表現(xiàn)出一致性，確保結(jié)果的可靠性。

 熔解曲線 

熔解曲線分析是在PCR擴增結(jié)束后進(jìn)行的，通過逐漸升高溫度來分析PCR產(chǎn)物的特性。熔解曲線顯示了DNA雙鏈在特定溫度下解鏈的過程，能夠幫助確認(rèn)擴增產(chǎn)物的特異性和純度。

1.原始圖譜與導(dǎo)數(shù)圖譜

熔解曲線原始圖譜通常展示了PCR擴增產(chǎn)物在不同溫度下的熒光強度變化。

原始圖譜示意圖

熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖譜主要用于更清晰地展示PCR產(chǎn)物在不同溫度下的解離特性。

導(dǎo)數(shù)圖譜示意圖

2.熔解曲線解析

通常情況下，熒光定量PCR擴增的產(chǎn)物長度在80到200個堿基對之間，對應(yīng)的熔解溫度大約在80到90℃。如果陰性對照沒有擴增，可以通過熔解曲線來驗證擴增產(chǎn)物的特異性：

單峰：如果在80到90℃之間出現(xiàn)一個清晰的單峰，說明PCR產(chǎn)物特異性很好，擴增成功。

雙峰：如果出現(xiàn)兩個峰，主峰在80到90℃之間，雜峰在80℃以下（通常60到75℃），可能是存在引物二聚體。可以嘗試提高退火溫度、降低引物濃度或重新設(shè)計引物來改善。

非特異性擴增：如果主峰在80到90℃，而在90℃以上又有雜峰，通常表示非特異性擴增。若是基因組DNA污染導(dǎo)致的，可以通過設(shè)計跨內(nèi)含子的引物或去除基因組DNA來解決。

 標(biāo)準(zhǔn)曲線 

構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成至少5個不同濃度。橫軸代表起始拷貝數(shù)，縱軸為Ct值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以建立Ct值與拷貝數(shù)之間的定量關(guān)系。

標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線的一些參數(shù)能夠反映熒光定量PCR體系的性能，其中斜率反映了PCR的擴增效率。理論上斜率為-3.32，表示100%的擴增效率，這意味著每個循環(huán)PCR產(chǎn)物量理論上翻倍。

實際實驗中，PCR反應(yīng)并非每個循環(huán)都實現(xiàn)完美倍增，通常有以下兩種情況：

1. 若擴增效率低于100%，可能是由于引物、試劑或反應(yīng)條件不合適，或標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不準(zhǔn)確。

2. 若擴增效率高于100%，則可能存在抑制因素，如模板質(zhì)量差或濃度過高，非特異性擴增也可能導(dǎo)致效率過高，需要通過熔解曲線進(jìn)一步驗證。

因此，擴增效率在90%至110%的范圍內(nèi)，仍可用于數(shù)據(jù)分析。但效率偏離此范圍，則需謹(jǐn)慎對待結(jié)果，并追溯潛在因素。

好的，熒光定量的三種曲線講解就到這里了，希望大家有所收獲~點贊關(guān)注康旭禾生物，不定期給大家分享更多實用的干貨！

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