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細胞增殖是生物體的重要生命特征，指細胞在周期調(diào)控因子的作用下，通過DNA復制等反應，完成細胞分裂的過程。增殖檢測一般是分析分裂中細胞的數(shù)量變化，進而反映細胞的生長狀態(tài)及活性，目前廣泛應用于腫瘤生物學，分子生物學，藥代動力學等領域。

細胞增殖檢測的方法眾多，應用非常廣泛，按檢測原理主要分為4 類：檢測DNA合成、檢測代謝活性、檢測細胞增殖相關抗原和檢測ATP濃度。其中，細胞DNA合成檢測是通過測定細胞的DNA合成量來評價細胞的增殖能力，直接測定DNA合成是檢測細胞增殖最準確的方法，它是測定物質(zhì)毒性、評估藥物安全評價、判斷細胞健康、細胞增殖等研究方向常用方法之一，常用的檢測試劑主要是EdU、BrdU等。

實驗原理

EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）與BrdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，它們能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復制的DNA分子，然后分別利用免疫熒光技術、與Apollo熒光染料特異性反應檢測細胞增殖情況。

傳統(tǒng)的BrdU有一大缺點，就是需要變性DNA后才能與抗體結(jié)合，但這就破壞了DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，影響了其他染料的結(jié)合染色，導致染色彌散，準確性降低等問題。而EdU檢測法更簡單、更快速、更準確，不需要嚴苛的樣品變性(酸解、熱解、酶解)處理，有效地避免了樣品損傷，有助于在組織、器官的整體水平上觀測細胞增殖的真實情況，具有更高的靈敏度和更快的檢測速度。這是一種新型的非放射性同位素細胞增殖檢測的方法，在細胞培養(yǎng)、實體組織及臨床研究中得到了廣泛的應用。該技術可用于細胞成像、流式、細胞示蹤、DNA損傷修復檢測、線粒體活性檢測以及病毒增殖活性檢測等。

實驗步驟

細胞培養(yǎng)

收集細胞計數(shù)，調(diào)整細胞懸液以2.5×10^5個/孔接種于提前置有爬片的12孔板中，過夜培養(yǎng)。

藥物處理

按照不同分組處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

EdU標記

用10 mM EdU溶液在無血清培養(yǎng)基中制備2 X EdU工作溶液，將2 X EdU溶液添加到等體積的培養(yǎng)基中，37 ℃孵育2 h。

細胞固定

去除培養(yǎng)基，加入0.5 mL 4%多聚甲醛固定液，室溫固定15 min。

通透

去除固定液，PBS洗3次，加入0.5 mL 0.3% Triton X-100通透劑，室溫孵育15 min。

Click反應

去除通透劑，PBS洗3次，配制Click Additive Solution，每孔加入200 μL反應液，室溫避光孵育30 min。

封片

去除反應液，PBS洗3次，加入含DAPI的抗熒光衰減封片劑，室溫孵育10 min。

拍照

注意事項

1. 加入含有Edu的培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基的用量以沒過細胞為適宜。

2. 根據(jù)培養(yǎng)細胞種類不同，確定細胞生長周期，再進一步確定Edu培養(yǎng)基的培養(yǎng)時間，大多數(shù)細胞為2小時培育時間。

3. 細胞類型、培養(yǎng)液種類、細胞密度、細胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細胞中的量，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索。

4. 染色完成后，最好立即進行觀察。如若條件限制，請4℃避光保存，保存時間不宜過長，不超過3天。

5. Click Additive配制成溶液后請注意適當分裝。如果溶解后有白色物質(zhì)析出，可上下顛倒多次，待全部溶解后使用。