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ell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK8）是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測(cè)試劑。

WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，是一種類似于MTT的化合物，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情況下，被線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物（formazan）。

細(xì)胞增殖越多越快，顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺，對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

No.1

應(yīng)用領(lǐng)域

CCK8（Cell Counting Kit-8）實(shí)驗(yàn)作為一種高效、便捷的細(xì)胞活性檢測(cè)方法，在多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

在藥物研發(fā)領(lǐng)域，CCK8 實(shí)驗(yàn)是評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞增殖、毒性影響的重要手段?？蒲腥藛T通過(guò)向培養(yǎng)的細(xì)胞中加入不同濃度的藥物，利用 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞活性變化，篩選具有潛在治療效果的藥物，同時(shí)評(píng)估藥物的安全性和毒性。例如，在抗癌藥物研發(fā)中，通過(guò) CCK8 實(shí)驗(yàn)可以判斷藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果，為后續(xù)臨床試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支持。

在細(xì)胞生物學(xué)研究中，CCK8 實(shí)驗(yàn)常用于研究細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、增殖能力以及細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制。通過(guò)對(duì)不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞活性的檢測(cè)，探究細(xì)胞在各種因素影響下的生長(zhǎng)變化。比如，研究細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，或是外界環(huán)境因素（如溫度、酸堿度）對(duì)細(xì)胞活性的影響。

此外，在毒理學(xué)研究中，CCK8 實(shí)驗(yàn)可用于檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)、重金屬等對(duì)細(xì)胞的毒性作用，評(píng)估環(huán)境污染物對(duì)生物體細(xì)胞的潛在危害，為環(huán)境保護(hù)和職業(yè)健康提供科學(xué)依據(jù)。在干細(xì)胞研究領(lǐng)域，CCK8 實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虮O(jiān)測(cè)干細(xì)胞的增殖能力和分化過(guò)程中的活性變化，有助于優(yōu)化干細(xì)胞培養(yǎng)和分化條件。

No.2

實(shí)驗(yàn)原理

CCK8 實(shí)驗(yàn)的原理基于細(xì)胞內(nèi)線粒體中的脫氫酶。活細(xì)胞內(nèi)線粒體中的脫氫酶能夠?qū)?CCK8 試劑中的 WST-8（化學(xué)名：2-(2 - 甲氧基 - 4 - 硝基苯基)-3-(4 - 硝基苯基)-5-(2,4 - 二磺酸苯)-2H - 四唑單鈉鹽）還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan）。

產(chǎn)生的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，細(xì)胞活性越高，線粒體脫氫酶活性越強(qiáng)，生成的甲臜就越多。

通過(guò)酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（OD 值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或直接比較 OD 值，即可準(zhǔn)確反映細(xì)胞的活性和數(shù)量 。

No.3

實(shí)驗(yàn)步驟

一、鋪板

1. 對(duì)前一天培養(yǎng)好的細(xì)胞消化、離心、計(jì)數(shù)。

2. 在96孔板上接種100μL 3000-7000/孔的細(xì)胞，在37℃、5% CO2、90%濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)12-24 h。

注意：

具體的細(xì)胞數(shù)量會(huì)根據(jù)細(xì)胞的大小和增殖速度而定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組需設(shè)置3-5個(gè)復(fù)合孔。

因最外圈會(huì)出現(xiàn)邊緣效應(yīng)（邊緣孔的濕度較中間孔低，水分揮發(fā)的現(xiàn)象更為嚴(yán)重），96孔板最外圈不做任何處理加入200μL PBS或細(xì)胞培養(yǎng)液。

細(xì)胞鋪板時(shí)，一定要邊混勻細(xì)胞邊鋪板，最好用排槍鋪板，減少鋪板所用時(shí)間，鋪板后立即觀察鋪板密度是否均勻，如果不均勻則標(biāo)記出密度不均勻孔，棄去該孔。

二、給藥

按照梯度進(jìn)行細(xì)胞給藥處理，通常每組至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，給藥梯度一般為倍數(shù)稀釋，可設(shè)置2或5梯度，給藥結(jié)束后細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育。

注意：

給藥方法因人而異，可以吸去原有培養(yǎng)基再給藥，也可以不棄去原有培養(yǎng)基，直接100μL+100μL給藥，但此時(shí)需要注意濃度配成終濃度的2倍。

三、結(jié)果檢測(cè)

貼壁細(xì)胞：吸棄原細(xì)胞培養(yǎng)液，按照 CCK8試劑：細(xì)胞培養(yǎng)液=1：10，對(duì)每個(gè)孔加入90-110μL 含CCK8溶液的細(xì)胞培養(yǎng)液；

懸浮細(xì)胞：直接在原培養(yǎng)液內(nèi)加入10μL CCK8溶液。

注意：

CCK-8試劑需要避光處理，在加入試劑時(shí)需注意對(duì)環(huán)境進(jìn)行避光處理，加CCK-8試劑時(shí)的速度要快，減少試劑在移液器上的殘留，加入CCK-8試劑后輕輕震蕩96孔板，避免加樣時(shí)由于CCK-8 殘留在槍頭或壁上上所帶來(lái)的誤差。

加入完畢后細(xì)胞繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5-3h。

孵育完成后，使用酶標(biāo)儀在450nm 處檢測(cè)吸光度。

注意：

建議每半小時(shí)測(cè)定一次OD值，使其保持在1至2之間后固定顯色時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

用Excel及Graphpad Prism處理并分析結(jié)果。

結(jié)果示例圖：

No.4

檢測(cè)與數(shù)據(jù)處理

孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD 值）。記錄數(shù)據(jù)后，利用 Excel、GraphPad Prism 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率或細(xì)胞毒性等指標(biāo)。

No.5

CCK8常見問題

CCK8法細(xì)胞毒活性篩選實(shí)驗(yàn)中會(huì)遇到的常見問題

（1）一個(gè)孔中應(yīng)接種多少個(gè)細(xì)胞？

當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100μl 培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100μl 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

（2）哪些物質(zhì)會(huì)影響CCK8的測(cè)定？

當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響CCK-8的測(cè)定，例如含有維生素C的Glucose等。在有酚紅存在的情況下，可通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去，不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。

（3）能否用384孔板或24孔板進(jìn)行試驗(yàn)？

可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養(yǎng)基體積20%的量。

（4）CCK-8能否對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色？

不能。因?yàn)镃CK-8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST-8)，并通過(guò)電子載體PMS將活細(xì)胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

（5）在實(shí)驗(yàn)中吸光度值太高，如果不能減少細(xì)胞數(shù)量，如何解決？

可以縮短加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間。例如: 可以把加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由2小時(shí)縮短為1小時(shí)。

（6）設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是什么？必須設(shè)定嗎？

不一定要設(shè)定。CCK-8試劑在參比波長(zhǎng)沒有吸光度。設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來(lái)的吸收。

（7）CCK-8檢測(cè)溶液對(duì)細(xì)胞是否有毒？

加到培養(yǎng)基中的CCK-8是沒有毒性的，因?yàn)楸幌♂屃?0倍。因此，長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，如過(guò)夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液在CCK-8檢測(cè)后還可以用于其他細(xì)胞增殖檢測(cè)，如結(jié)晶紫檢測(cè)，中性紅檢測(cè)或者DNA熒光檢測(cè)等。由于每種細(xì)胞對(duì)于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)，先檢測(cè)一下細(xì)胞在加入CCK-8培養(yǎng)后的活力。

（8）CCK-8能否檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞？

可以檢測(cè)E.coli，但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。向100μl E.coli培養(yǎng)液中加入10μl CCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4個(gè)小時(shí)或過(guò)夜。

（9）CCK-8穩(wěn)定嗎？

CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長(zhǎng)期保存，我們推薦-20℃的儲(chǔ)藏條件。CCK-8若反復(fù)解凍和冰凍將會(huì)增加空白吸收，從而影響檢測(cè)結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存。

（10）每次測(cè)定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？

可能會(huì)有以下幾個(gè)原因：1. 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測(cè)定孔用。2. 有可能會(huì)因?yàn)镃CK-8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK-8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。3. 每孔的細(xì)胞數(shù)量過(guò)多或過(guò)少。請(qǐng)預(yù)先在1,000-100,000個(gè)/孔范圍內(nèi)摸索條件。

（11）如何設(shè)定空白對(duì)照？

在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn))時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在不含細(xì)胞，加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度作為空白對(duì)照。

（12）在CCK-8顯色過(guò)程中，如何終止反應(yīng)？

有以下幾種方法（96孔板）：①在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置4℃冰箱內(nèi)。②每孔加10μl 0.1 MHCL溶液。③每孔加10μl的 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在24小時(shí)之內(nèi)測(cè)定。

（13）必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎？

不一定。如果要向保持細(xì)胞的最好狀態(tài)，建議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。如果不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng) ，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可能會(huì)不穩(wěn)定。也有人不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，但在做標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)時(shí)需要統(tǒng)一檢測(cè)條件。

（14）CCK-8對(duì)于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣？

不一樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對(duì)于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過(guò)延長(zhǎng)CCK-8的加入時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來(lái)解決。

（15）懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在數(shù)量上有何區(qū)別？

懸浮細(xì)胞由于染色比較困那，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。貼壁細(xì)胞染色比較容易，若細(xì)胞數(shù)量過(guò)大，有時(shí)吸光度會(huì)超過(guò)酶標(biāo)儀的讀數(shù)。

（16）應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？

建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣，對(duì)于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號(hào)不一樣，靈敏度可能會(huì)有輕微的差異，對(duì)于不同的批號(hào)建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（17）有時(shí)在藥物作用情況下，細(xì)胞已經(jīng)死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計(jì)算細(xì)胞數(shù)量？

不能。由于CCK-8是通過(guò)和細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶進(jìn)行反應(yīng)間接反映活細(xì)胞數(shù)量，如果細(xì)胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測(cè)定的細(xì)胞數(shù)量將會(huì)比真實(shí)值高，不能真實(shí)反映活細(xì)胞數(shù)量，建議采用別的方法測(cè)定。

（18）實(shí)驗(yàn)前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢是什么原因？
a. 細(xì)胞狀態(tài)不好：可能是因?yàn)閭鞔螖?shù)過(guò)多或者細(xì)胞本身存在異常，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降。此時(shí)，可以嘗試更換細(xì)胞株或優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件。
b. 培養(yǎng)條件不合適：如培養(yǎng)基不合適、血清濃度不合適、溫度和濕度不適合等。此時(shí)，可以嘗試調(diào)整培養(yǎng)條件，選擇更適合的培養(yǎng)基和血清。
c. 污染：細(xì)胞可能會(huì)被細(xì)菌、支原體等微生物感染，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。此時(shí)，需要進(jìn)行消毒和更換新鮮的培養(yǎng)基。

d. 細(xì)胞老化：細(xì)胞生長(zhǎng)到一定階段后，會(huì)逐漸進(jìn)入老化狀態(tài)，導(dǎo)致增殖能力下降。此時(shí)，可以嘗試進(jìn)行細(xì)胞換株或者優(yōu)化培養(yǎng)條件。

（19）實(shí)驗(yàn)前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡是什么原因？
a. 血清濃度不合適：血清濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此時(shí)，可以嘗試調(diào)整血清濃度。
b. 溫度和濕度不適合：如果溫度過(guò)高或濕度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此時(shí)，可以嘗試調(diào)整溫度和濕度。
c. 細(xì)胞狀態(tài)異常：如果細(xì)胞狀態(tài)異常，如出現(xiàn)染色體異常、基因突變等情況，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此時(shí)，需要進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)和表型分析等實(shí)驗(yàn)來(lái)確認(rèn)細(xì)胞的性質(zhì)。

（20）文獻(xiàn)報(bào)道IC50值和實(shí)際測(cè)定值不一致是什么原因？

a.文獻(xiàn)IC50測(cè)定方法和實(shí)際測(cè)定所用方法存在差異；

b.不同實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞株來(lái)源、代次、培養(yǎng)方法存在差異，可能會(huì)影響細(xì)胞株對(duì)受試藥物的敏感性；

c.實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中存在的誤差；

d.受試藥物的純度、配制方法等可能存在差異。

故文獻(xiàn)報(bào)道IC50值和實(shí)際測(cè)定值不一致的情況下需要客觀分析。

主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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