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模型差異總結(jié)

模型優(yōu)缺點(diǎn)與應(yīng)用場(chǎng)景

模型構(gòu)建案例

1. 實(shí)驗(yàn)方法

① 基因敲除（Knockout）

技術(shù)：CRISPR/Cas9或同源重組靶向刪除特定外顯子（如F8 exon 16/17）。

應(yīng)用：小鼠血友病A/B型。

② 轉(zhuǎn)基因（Transgenic）

技術(shù)：顯微注射人類(lèi)突變基因（如R539C、HLAD28/1*1501）至胚胎干細(xì)胞或受精卵。

應(yīng)用：模擬人類(lèi)錯(cuò)義突變。

③ 敲入（Knock-in）

技術(shù)：靶向插入特定突變（如R33Q、G581E）至內(nèi)源基因位點(diǎn)，保留表達(dá)框架。

應(yīng)用：研究CRM+/-表型。

④ 自然突變模型

技術(shù)：篩選自然發(fā)生的突變個(gè)體（如犬外顯子22倒位）。

應(yīng)用：犬血友病A型（Graham等, 1949；Hough等, 2002）。

2. 實(shí)驗(yàn)材料

動(dòng)物品系：小鼠：C57BL6、BALB/c、C3H等近交系；犬：Chapel Hill、Queen品系。

基因工具：CRISPR/Cas9系統(tǒng)、重組載體、胚胎干細(xì)胞（傳統(tǒng)方法）。

突變類(lèi)型：外顯子倒位、錯(cuò)義突變（R539C）、提前終止密碼子。

3. 造模后驗(yàn)證與檢測(cè)

3.1 病理檢測(cè)

① 凝血功能評(píng)估：

APTT（活化部分凝血活酶時(shí)間）：顯著延長(zhǎng)（正常值：25-35秒；模型可達(dá)>60秒）。

凝血因子活性（FVIII:C/FIX:C）：ELISA或發(fā)色底物法檢測(cè)，重型模型活性<1%。

② 出血表型觀(guān)察：

尾部出血時(shí)間：小鼠>10分鐘（正常<2分鐘）。

自發(fā)性出血：關(guān)節(jié)腫脹（犬模型）、肌肉血腫（綿羊模型）。

3.2 分子蛋白檢測(cè)

① 基因型驗(yàn)證：

PCR擴(kuò)增+Sanger測(cè)序：確認(rèn)外顯子敲除或突變位點(diǎn)（如L176P）。

Southern blot：用于大片段缺失或倒位檢測(cè)（如犬外顯子22倒位）。

② 蛋白表達(dá)分析：

Western blot：檢測(cè)FVIII/FIX蛋白缺失（敲除模型）或異常大小（突變模型）。

ELISA：定量血漿凝血因子水平（CRM+模型可能顯示正?？乖珶o(wú)活性）。

③ CRM狀態(tài)鑒定：

交叉反應(yīng)抗體：CRM+（蛋白存在但無(wú)功能，如R33Q）；CRM-（蛋白完全缺失，如G379E）。

注意事項(xiàng)

1. 品系選擇：C57BL6小鼠免疫耐受性強(qiáng)，適合基因治療；BALB/c易產(chǎn)生抗體，適合免疫研究。

2. CRM分類(lèi)：CRM+模型需結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)（如凝血活性檢測(cè)）明確表型。

3. 自然突變模型：犬外顯子22倒位與人類(lèi)重型血友病A高度相似，是金標(biāo)準(zhǔn)模型。

通過(guò)系統(tǒng)選擇模型，可針對(duì)不同研究目標(biāo)（機(jī)制探索、治療開(kāi)發(fā)、長(zhǎng)期安全性）優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書(shū)寫(xiě)作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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