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WB實(shí)驗(yàn)保姆級(jí)教程

WB（Western Blot，蛋白質(zhì)印跡法）實(shí)驗(yàn)的原理是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的特性來檢測(cè)特定蛋白質(zhì)。WB作為分子生物學(xué)中最常用的實(shí)驗(yàn)，包含了很多技巧與知識(shí)，想做出漂亮的WB檢測(cè)結(jié)果不是一件易事。

WB標(biāo)準(zhǔn)流程：樣本制備→凝膠上樣、電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→抗體孵育→顯影

WB實(shí)驗(yàn)流程和結(jié)果解析

#01

實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)開始前一定要做的事情，是對(duì)所研究的目的蛋白在待測(cè)樣本中的表達(dá)水平、蛋白大小、翻譯后修飾等背景信息進(jìn)行深入的了解，同時(shí)也需要設(shè)置嚴(yán)格的陰性、陽性對(duì)照樣本。這將有助于在實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)異常結(jié)果時(shí)進(jìn)行排查分析。通常我們會(huì)參考文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫進(jìn)行樣本的選擇，下面列舉幾個(gè)常見數(shù)據(jù)庫：該蛋白在什么組織中表達(dá)？1）網(wǎng)址：www.biogps.org通過mRNA表達(dá)水平給您參考估計(jì)不同樣本中目的蛋白的表達(dá)水平；樣本種屬可以選擇人、小鼠、大鼠等。還可以鏈接其他的數(shù)據(jù)庫。2）網(wǎng)址：www.proteinatlas.org簡(jiǎn)稱HPA數(shù)據(jù)庫，提供人類蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞的分布，并用免疫組化技術(shù)。這是一個(gè)大規(guī)模蛋白質(zhì)研究項(xiàng)目，主要目的是繪制人體組織和細(xì)胞中表達(dá)基因編碼的蛋白位置。不過這個(gè)網(wǎng)站只針對(duì)人類蛋白質(zhì)。該蛋白有沒有其他的修飾形式？1）網(wǎng)址：www.uniprot.org了解目的蛋白的基因名、別名、功能、可變剪切體、蛋白表達(dá)位置、可修飾類型等。2）網(wǎng)址：www.phosphositeplus.org是蛋白質(zhì)翻譯后修飾權(quán)威數(shù)據(jù)庫，查閱修飾類蛋白的表達(dá)條件和豐度、刺激方式等。

#02

WB 實(shí)驗(yàn)方法

一、蛋白提取

  吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，并用PBS溶液漂洗細(xì)胞2次，倒掉PBS后向每孔加入一定量的 RIPA裂解液+PMSF+蛋白酶/磷酸酶抑制劑（注：每種細(xì)胞不一樣，加裂解液的量需要自己把控，最后上樣10-20 μL為好；一般107個(gè)細(xì)胞中加入1 mL抽提試劑，5×106個(gè)細(xì)胞中加入0.5 mL抽提試劑），并于冰浴條件下裂解10 min。刮取收集蛋白至相應(yīng)標(biāo)號(hào)離心管中，超聲（60HZ,超聲3次，每次45s）并離心，4℃、12000 rpm 條件下離心15min ，取上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

注：裂解液常見組分與選擇：

1. 蛋白裂解緩沖液中，通常含有變性劑、鹽、酶抑制劑，這些試劑可以分離樣本、溶解蛋白、并且防止蛋白的降解。1.緩沖體系

一定pH范圍的緩沖體系，為蛋白提供了一個(gè)穩(wěn)定環(huán)境，并增加蛋白溶解度。常用近似生理pH狀態(tài)的Tris-HCl或HEPES緩沖體系，pH7.4。Tris-HCl（pKa=8.1）pH緩沖范圍為7.0-9.2，其對(duì)溫度較為敏感。HEPES（pKa=7.55）pH緩沖范圍為6.5-8.5。

2.鹽離子

在適當(dāng)鹽離子濃度下，保持蛋白溶解狀態(tài)。選擇近似生理狀態(tài)下的150 mM的NaCl，不會(huì)對(duì)破壞蛋白以及蛋白間相互作用產(chǎn)生影響。

3.螯合劑

螯合金屬離子，以防止蛋白提取物過于黏稠，導(dǎo)致溶解度下降。另外，螯合劑亦可與某些酶發(fā)生相互作用，以抑制酶活性。

4.還原劑

加入一定量的還原劑保護(hù)蛋白質(zhì)上自由的巰基不被氧化，從而避免蛋白質(zhì)的聚集或變性。常用β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT），后者還原能力強(qiáng)于前者。β-巰基乙醇具有揮發(fā)性，加入緩沖液中以后較短時(shí)間內(nèi)會(huì)被氧化，會(huì)對(duì)蛋白活性產(chǎn)生影響，其使用濃度為5-20 mM/L。而DTT具有更強(qiáng)的還原能力，且在氧化以后能夠形成穩(wěn)定的分子內(nèi)二硫鍵，不會(huì)影響蛋白巰基，使用濃度相對(duì)偏低為0.5-1 mM/L。長(zhǎng)期保存建議使用DTT，但DTT溶液不穩(wěn)定，需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

5.去垢劑

   去垢劑即表面活性劑，其通過分子結(jié)構(gòu)特征，表面活性劑分子的疏水段插入膜的磷脂雙分子層，而改變其通透性，最終破壞膜結(jié)構(gòu)。因此，表面活性劑的強(qiáng)度直接決定了裂解細(xì)胞的強(qiáng)度。裂解液中所使用的表面活性劑主要可分為兩大類：陰離子型表面活性劑和非離子型表面活性劑。常用表面活性劑如下：

十二烷基硫酸鈉（SDS）：陰離子表面活性劑，具有很強(qiáng)的破壞力，基本可以使所有的蛋白溶解，并破壞其天然構(gòu)象結(jié)構(gòu)。SDS與蛋白分子以1.4:1的比例進(jìn)行結(jié)合，可以有效的覆蓋蛋白本身所帶的電荷情況。SDS的臨界膠束溫度較高，在低溫時(shí)即會(huì)發(fā)生沉淀，且在鉀鹽存在時(shí)，沉淀效果會(huì)更明顯。另外溶液離子強(qiáng)度越強(qiáng)，會(huì)降低離子型去污劑的臨界膠束濃度，使得這種蛋白溶解效果更強(qiáng)。

脫氧膽酸鈉（NaDOC）：也是一種離子型表面活性劑，作用較SDS弱。

Triton X-100：是一種非離子型表面活性劑?？梢云茐牡鞍踪|(zhì)與脂質(zhì)間的相互作用，但并不使蛋白變性，也不破壞蛋白與蛋白間的連接，能夠保留蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。其具有較低的臨界膠束濃度，在64下，可觀察到兩相分離。

NP-40：非離子型表面活性劑，對(duì)核膜的破壞作用較弱，與蛋白結(jié)合力強(qiáng)，可確保蛋白的充分溶解和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，特別適用于膜蛋白非變形條件下的溶解。

Tween 20：溫和非離子型表面活性劑，蛋白溶解能力較弱，也不會(huì)破壞蛋白結(jié)構(gòu)，并不作為蛋白裂解液的常見成分。

二、蛋白定量與制樣

1. 標(biāo)準(zhǔn)品制備（標(biāo)準(zhǔn)曲線 R2應(yīng)＞0.99）：取8個(gè)離心管編號(hào)1-8，按照試劑盒說明配置標(biāo)準(zhǔn)品，各取20 μL標(biāo)準(zhǔn)品加入到96孔板各孔中，并做3個(gè)復(fù)孔。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品蛋白濃度檢測(cè)：于上述96孔板樣本孔中每孔加入20 μL 預(yù)先稀釋好的待測(cè)樣品（注：直接用蛋白原液檢測(cè)樣品蛋白濃度一方面損耗太多，另一方面有可能會(huì)超過標(biāo)準(zhǔn)品吸光度的最高值，因此這里蛋白原液稀釋了多少倍后期記得計(jì)算回來），BCA試劑盒中的A和B工作液混勻后向標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品中每孔加入200 μL反應(yīng)液，輕輕拍打混勻后，于37℃恒溫箱中避光孵育30 min。酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm~630nm 處吸光度，并計(jì)算蛋白濃度。（注：根據(jù)該種蛋白濃度計(jì)算方法得到的樣品蛋白濃度，每個(gè)樣品的上樣體積不同，但不同樣品的最終蛋白上樣濃度是相同的。）

3.  蛋白變性處理：按照蛋白液（上清）：上樣緩沖液=4:1的比例加入5×上樣緩沖液（自配或商品化均可），100℃煮沸5 -10 min，隨后將蛋白樣品保存于-80℃冰箱。

注：

細(xì)胞也可以直接用胰酶消化下來，如果后續(xù)提取的蛋白只是用于WB實(shí)驗(yàn)，那么用含或不含EDTA的胰酶消化都可以，若要做流式不能用含EDTA的胰酶消化，具體的需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。如果短期內(nèi)不提蛋白，則可以先把細(xì)胞收集起來，用PBS洗兩次，然后再12000rpm,離心5min,把PBS倒掉，用移液槍將殘留的PBS吸凈，之后放到-80度冰箱中保存。細(xì)胞提蛋白加入裂解液后可以直接加入磁珠，超聲破碎，60Hz，30s,重復(fù)三次，細(xì)胞上樣通常上10-30μg蛋白樣品/孔。    

1. 根據(jù)蛋白定量結(jié)果，計(jì)算含相同蛋白量的樣品體積。

2. 加入適量的上樣緩沖液（通常為 5×），混合均勻。

3. 95 - 100°C 加熱 5 - 10 分鐘，使蛋白變性。

三、電泳

1. 制備分離膠和濃縮膠：根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠，先灌制分離膠，待凝固后灌制濃縮膠。

2. 上樣：將處理好的樣品加入上樣孔中，同時(shí)加入蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。

3. 電泳：恒壓或恒流電泳，先 80 V 使樣品在濃縮膠中濃縮成一條線，然后 120 V 直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。

四、轉(zhuǎn)膜

1. 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜裝置：依次放入海綿、濾紙、凝膠、PVDF 膜或 NC 膜、濾紙、海綿，注意各層之間不能有氣泡。

2. 轉(zhuǎn)膜：恒流 200 - 300 mA 轉(zhuǎn)膜 1 - 2 小時(shí)（根據(jù)蛋白分子量和膜的類型調(diào)整）。

注：轉(zhuǎn)膜的方法

WB實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)膜是將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到固相介質(zhì)（如PVDF膜、NC膜）上的過程。以下是一些常見的轉(zhuǎn)膜方法：

- 濕轉(zhuǎn)：將“轉(zhuǎn)膜三明治”完全浸沒在Tris-甘氨酸轉(zhuǎn)膜緩沖液中并施以電壓，在電場(chǎng)的作用下，負(fù)電荷蛋白向正極移動(dòng)，蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到固相介質(zhì)上，并與其相結(jié)合形成印跡。

- 半干轉(zhuǎn)：三明治在轉(zhuǎn)膜過程中并沒有浸沒在轉(zhuǎn)膜液中，但在轉(zhuǎn)膜之前用相應(yīng)的電轉(zhuǎn)液浸泡濾紙、膜和膠一定時(shí)間。

在選擇轉(zhuǎn)膜方法時(shí)，需要考慮以下因素： 

- 蛋白分子量：一般來說，濕轉(zhuǎn)主要用于轉(zhuǎn)漬大分子量蛋白質(zhì)，而半干轉(zhuǎn)主要用于轉(zhuǎn)漬小分子量蛋白質(zhì)。

- 實(shí)驗(yàn)條件和要求：濕轉(zhuǎn)耗費(fèi)轉(zhuǎn)膜液較多，操作相對(duì)復(fù)雜，但適應(yīng)廣泛，對(duì)溫度的控制較好，不容易出錯(cuò)。半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜效率高，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但需要注意控制轉(zhuǎn)膜條件以獲得較好的轉(zhuǎn)膜效果。

無論選擇哪種轉(zhuǎn)膜方法，在轉(zhuǎn)膜過程中都需要注意以下幾點(diǎn)：

- 保持轉(zhuǎn)膜緩沖液的新鮮和正確的配方。

- 控制轉(zhuǎn)膜時(shí)間和電壓，避免過度轉(zhuǎn)膜或轉(zhuǎn)膜不足。

- 確保轉(zhuǎn)膜三明治的組裝正確，排除氣泡。

- 在轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆忾]和清洗步驟，以減少非特異性結(jié)合。

五、封閉

1. 將膜放入封閉液（5%脫脂奶粉或 BSA 溶液）中，室溫?fù)u床上封閉 1 - 2 小時(shí)。

六、一抗孵育

1. 用封閉液稀釋一抗，根據(jù)抗體說明書選擇合適的稀釋比例。

2. 將膜放入一抗溶液中，4°C 搖床孵育過夜或室溫孵育 2 - 3 小時(shí)。

注：抗化孵育

1.抗體孵育原理：一抗識(shí)別膜上蛋白或修飾性抗原表位，二抗識(shí)別一抗恒定區(qū)從而與一抗結(jié)合，最終通過二抗攜帶的熒光或酶顯色信號(hào)，達(dá)到對(duì)樣本中目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)的目的。

2.抗體如何選擇：

對(duì)于任何一種目的蛋白，都有不止一種有效抗體；為縮小選擇范圍，我們通?？紤]以下幾個(gè)方面：A.文獻(xiàn)引用：根據(jù)官網(wǎng)了解該抗體發(fā)表文獻(xiàn)的數(shù)量，如果發(fā)現(xiàn)該靶點(diǎn)的抗體有多個(gè)貨號(hào)，那么盡可能選擇發(fā)表文獻(xiàn)較多的貨號(hào)。B.反應(yīng)性：根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬性選擇合適的抗體，比如，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是小鼠，那么一抗需要選擇抗小鼠。C.實(shí)驗(yàn)應(yīng)用：根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)類型選擇廠家驗(yàn)證過的抗體，盡可能選擇的抗體能夠滿足多種類型實(shí)驗(yàn)，保證抗體的使用價(jià)值?？贵w偶聯(lián)物：標(biāo)簽結(jié)合在抗體上使抗體的結(jié)合可見，選擇標(biāo)簽抗體以檢測(cè)方法的為依據(jù)進(jìn)行選擇。一般推薦使用HRP標(biāo)記二抗，不建議使用堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記二抗，因其不夠靈敏。在二抗種類的選擇上，二抗應(yīng)來源于產(chǎn)生一抗的物種。3.抗體孵育、洗滌注意事項(xiàng)一抗孵育、洗滌：a.將一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合適比例進(jìn)行稀釋；b.封閉結(jié)束后，將稀釋好的一抗工作液倒入孵育槽中,室溫2h或4°C過夜。c.一抗孵育結(jié)束后，加入TBSTBuffer洗滌4次，5min/次；抗體稀釋小tips：按照抗體說明書建議的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋使用，有時(shí)一抗和二抗的最佳濃度也取決于檢測(cè)試劑的靈敏度。一般來說，高倍稀釋一抗可減少非特異性信號(hào)，高倍稀釋酶標(biāo)二抗可最大限度降低整體的高背景。

七、洗膜

1. TBST 洗膜 3 次，每次 10 - 15 分鐘。

八、二抗孵育

1. 用封閉液稀釋二抗，通常稀釋比例為 1:5000 - 1:10000。

2. 室溫?fù)u床孵育 1 - 2 小時(shí)。

注：二抗孵育、洗滌：a.一抗洗滌結(jié)束前10min，將二抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合適比例進(jìn)行稀釋；b.洗滌結(jié)束后，將稀釋好的二抗工作液加入孵育槽中，室溫1h；c.

二抗孵育結(jié)束后，加入TBSTBuffer洗滌4次，5min/次。

九、洗膜

1. TBST 洗膜 3 次，每次 10 - 15 分鐘。

十、顯色

1. 配制 ECL 發(fā)光液，將膜浸泡其中 1 - 2 分鐘。

2. 取出膜，吸干多余發(fā)光液，放入化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光成像。

#03

常見問題及處理方法：

1.非特異條帶

◆ 抗體濃度過高：降低抗體濃度

◆ 封閉不足：提高封閉液濃度，如從 5% 提高到 7%；加封閉時(shí)間和/或溫度；向封閉緩沖溶液中加入 0.05% 的 Tween 20；抗體稀釋液采用相同的封閉液。

◆ SDS 使抗體和蛋白條帶發(fā)生非特異性結(jié)合：轉(zhuǎn)膜后洗滌印跡膜；在免疫檢測(cè)過程中不要使用 SDS。

◆ 抗體質(zhì)量：嘗試使用不同的抗體

2. 條帶弱或無條帶

◆ 抗體問題，低活性或低濃度、低親和力的一抗，錯(cuò)配的一抗和二抗：提高抗體濃度；抗體可能已經(jīng)喪失活性，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交以確定其活性和最佳濃度；測(cè)試不同一抗和/或一抗-二抗組合

◆ 抗原抗體反應(yīng)不足：增加凝膠中每個(gè)樣品的總蛋白上樣量；檢查樣品的完整性，確保蛋白未降解；抗原被封閉液封閉；嘗試不同的封閉液 (比如，在檢測(cè)磷酸化蛋白時(shí)避免使用牛奶)；優(yōu)化封閉液濃度，建議使用濃度為 3–5% 的 BSA 或脫脂奶粉；化學(xué)發(fā)光底物性能不佳；增加底物孵育時(shí)間；準(zhǔn)備少量工作液以確定底物是否已經(jīng)喪失活性。暗室內(nèi)，在底物工作液中加入少量 HPR 偶聯(lián)物則應(yīng)該會(huì)出現(xiàn)藍(lán)光。如果沒有的話，必定是底物或HRP 偶聯(lián)物已喪失活性；確保底物試劑盒中的兩個(gè)瓶子之間沒有發(fā)生交叉污染。兩種試劑之間如果發(fā)生交叉污染，則會(huì)引起試劑活性下降；疊氮化物是 HRP 的抑制劑，不要在二抗緩沖液中使用疊氮化物；印跡膜上抗體去除和再雜交；優(yōu)化抗體去除條件；僅在必要時(shí)進(jìn)行再雜交檢測(cè)；避免對(duì)同一印跡膜進(jìn)行多次重復(fù)再雜交

◆ 轉(zhuǎn)膜不足：轉(zhuǎn)膜時(shí)間過短，如果使用濕轉(zhuǎn)法，則需增加轉(zhuǎn)膜時(shí)間；轉(zhuǎn)膜電場(chǎng)過弱，增加轉(zhuǎn)膜電壓或電流；轉(zhuǎn)膜液未優(yōu)化，在轉(zhuǎn)膜液中加入 0.01-0.05%的 SDS；將轉(zhuǎn)膜液中的甲醇濃度減少至 5% 或更少；凝膠選擇不恰當(dāng)，使用更低百分比的聚丙烯酰胺凝膠；在轉(zhuǎn)膜后使用麗春紅染液染膜，考馬斯亮藍(lán)染液染膠，確認(rèn)轉(zhuǎn)移效率，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件；轉(zhuǎn)過了；轉(zhuǎn)膜時(shí)間過長(zhǎng)，減少時(shí)間；轉(zhuǎn)膜電場(chǎng)過強(qiáng)，降低轉(zhuǎn)膜電壓或電流；轉(zhuǎn)膜液未優(yōu)化，組裝“三明治”之前，在轉(zhuǎn)膜液中平衡凝膠 20 分鐘以降低凝膠中 SDS 濃度，從而避免小分子量蛋白的過度轉(zhuǎn)移；將轉(zhuǎn)膜液中的甲醇濃度增加至 40%。

◆ 凝膠選擇不恰當(dāng)，使用更高百分比的丙烯酰胺凝膠

◆ 當(dāng)目標(biāo)蛋白分子量小于 10 KD 時(shí)使用 Tris/tricine 凝膠。使用 0.2 μm 的膜解決小蛋白轉(zhuǎn)印過度的情況。

◆ 小蛋白會(huì)穿過大孔徑的印跡膜，在 0.45μm 的膜后疊加 0.2 μm 的膜檢測(cè)小蛋白轉(zhuǎn)印過度情況

3.信號(hào)過飽和

◆ 中空條帶：上樣量過高，降低每個(gè)樣品的總蛋白上樣量；抗體過多，降低一抗和/或二抗?jié)舛?；化學(xué)發(fā)光底物過靈敏，更換使用靈敏度較低的化學(xué)發(fā)光底物.

◆ 條帶過濃以至于條帶粘連在一起：樣品上樣量過大，降低每個(gè)樣品的總蛋白上樣量；抗體過多，降低一抗和/或二抗?jié)舛取?/p>

4.條帶上有氣泡

◆ “三明治”組裝不恰當(dāng)： 在組裝 “三明治”的時(shí)候使用更多的轉(zhuǎn)膜緩沖液；組裝“三明治”的時(shí)候碾掉了凝膠和膜之間所有的氣泡；在抗體孵育前用麗春紅染液 染膜，以檢查轉(zhuǎn)膜質(zhì)量。

5.轉(zhuǎn)膜不均勻

◆ 印跡膜部分變干或水化不均勻：確保整張印跡膜均勻浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中并充分平衡；PVDF 膜在放入緩沖液之前需要用 100% 的甲醇預(yù)先浸濕平衡；硬件問題；檢查濕轉(zhuǎn)裝置的線路連接；確保金屬平板清潔，無物理損傷，即便是金屬平板發(fā)生輕微彎曲也可以極；大地改變半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)的電場(chǎng)強(qiáng)度。

◆ 使用質(zhì)量可靠的轉(zhuǎn)膜儀（轉(zhuǎn)膜儀的勻電場(chǎng)是有技術(shù)含量的，所以買轉(zhuǎn)膜儀的錢不能省）

6.背景過強(qiáng)

◆ 一抗和/或二抗?jié)舛冗^高：稀釋一抗和/或二抗?jié)舛?；封閉不足；提高封閉液濃度， 如 3–5% 的牛血清蛋白、酪蛋白、 脫脂牛奶；降低封閉時(shí)間和/或溫度；向封閉液中加入 0.05% 的 Tween-20；抗體稀釋液采用相同的封閉液（加入 0.05%的 Tween-20)；使用了錯(cuò)誤的封閉液，一抗和/或二抗與封閉緩沖液中的蛋白相結(jié)合；嘗試其他封閉液(白蛋白、酪蛋白、 脫脂牛奶等）。在使用親和素-生物素；系統(tǒng)時(shí)不要使用牛奶來封閉印跡膜 — 牛奶含有生物素。

◆ 洗滌不足。

◆ 增加洗滌次數(shù)和緩沖液用量 (最少 5 × 5 分鐘)。

◆ 如果洗滌液中未含有 0.1%的 Tween -20，請(qǐng)?zhí)砑悠毓狻?nbsp;時(shí)間過長(zhǎng)。 

◆ 減少成像曝光時(shí)間。

◆ 印跡過程中印跡膜變干。

◆ 確保印跡膜保持濕潤(rùn)。

◆ 確保印跡膜一直覆蓋有足夠液體以防止其變干。

◆ 緩沖液重復(fù)利用導(dǎo)致污染。

◆ 使用新制緩沖液。

7.背景有污跡

◆ 部分印跡膜變干

◆ 確保印跡膜保持濕潤(rùn)

◆ 確保印跡膜一直覆蓋有足夠液體以防止其變干

◆ 洗滌緩沖液與某些印跡區(qū)域接觸不足

◆ 增加洗滌緩沖液用量

◆ 避免過多印跡堆疊在一個(gè)孵育容器內(nèi)

◆ 洗滌緩沖液與某些印跡區(qū)域接觸不足

◆ 使用干凈的或新的轉(zhuǎn)移“三明治”

◆ 印跡膜污染

◆ 請(qǐng)勿用手直接接觸印跡膜。一直配戴清潔手套或使用醫(yī)用鑷子

◆ 確保電泳設(shè)備、轉(zhuǎn)移設(shè)備和孵育盤清潔，遠(yuǎn)離外部污染源

8. 背景有斑點(diǎn)

◆ 凝膠碎片粘附于印跡膜之上

◆ 將印跡膜表面殘留的丙烯酰胺凝膠碎片移除成塊的封閉劑粘附于印跡膜之上

◆ 確保封閉劑在使用前完全溶解

◆ 向封閉緩沖溶液中加入 0.1% 的 Tween-20

◆ 抗體聚合

◆ 使用 0.2 μm 的過濾器過濾抗體緩沖液

◆ 使用新鮮抗體向抗體緩沖溶液中加入 0.1% 的 Tween-20

◆ 緩沖液污染

◆ 使用新的緩沖液

◆ 使用 0.2 μm 的過濾器過濾緩沖液

9.不同樣品間內(nèi)參蛋白含量不一致

◆ 在實(shí)驗(yàn)過程中，選為內(nèi)參的持家蛋白表達(dá)水平發(fā)生變化

◆ 在實(shí)驗(yàn)條件下識(shí)別并驗(yàn)證選用的內(nèi)參蛋白的一致性，即證實(shí)目前實(shí)驗(yàn)條件并不會(huì)改變?cè)搩?nèi)參蛋白的表達(dá)水平

◆ 用染料給膜上的總蛋白染色，并以膜上檢測(cè)到的總蛋白為內(nèi)參

◆ 內(nèi)參蛋白檢測(cè)信號(hào)飽和

◆ 在實(shí)驗(yàn)過程中，選為內(nèi)參的持家蛋白表達(dá)水平發(fā)生變化

◆ 減少上樣量以消除信號(hào)飽和

◆ 稀釋抗體濃度或減少孵育時(shí)間以避免檢測(cè)信號(hào)飽和

◆ 選擇另一個(gè)一致性表達(dá)的低豐度蛋白作為內(nèi)參

◆ 用染料給膜上的總蛋白染色，并以膜上檢測(cè)到的總蛋白為內(nèi)參

#04

提高 WB 實(shí)驗(yàn)特異性的方法

1. 優(yōu)化抗體選擇：選擇特異性高、親和力強(qiáng)的抗體。可通過查閱文獻(xiàn)、參考其他實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)或者進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)來篩選合適的抗體。

2. 保證蛋白樣品質(zhì)量：提取蛋白時(shí)，嚴(yán)格操作以減少蛋白降解和雜質(zhì)污染。確保蛋白的完整性和純度。

3. 充分封閉：選擇合適的封閉劑（如 5%脫脂奶粉或 BSA），并保證足夠的封閉時(shí)間，以有效封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

4. 優(yōu)化抗體孵育條件：控制抗體的濃度、孵育時(shí)間和溫度，避免過高濃度或過長(zhǎng)時(shí)間的孵育導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加。

5. 嚴(yán)格洗膜：增加洗膜的次數(shù)和時(shí)間，使用適當(dāng)?shù)南礈炀彌_液，充分去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)。

6. 設(shè)立對(duì)照：設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，有助于判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性。

7. 優(yōu)化電泳和轉(zhuǎn)膜條件：確保蛋白在電泳過程中分離良好，轉(zhuǎn)膜效率高且均勻，避免蛋白條帶的擴(kuò)散和重疊。

8. 避免交叉污染：在實(shí)驗(yàn)過程中，注意使用清潔的器具和試劑，防止交叉污染影響實(shí)驗(yàn)特異性。

#05

如何選擇WB 實(shí)驗(yàn)的二抗標(biāo)記物

1. 檢測(cè)方法和儀器：如果實(shí)驗(yàn)室有化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀器，辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的二抗通常是較好的選擇，因?yàn)樗鼈兡芘c化學(xué)發(fā)光底物產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)。若有熒光檢測(cè)設(shè)備，且對(duì)多重檢測(cè)有需求（同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)蛋白），則可考慮熒光標(biāo)記的二抗。

2. 靈敏度要求：如前所述，HRP 標(biāo)記的二抗一般具有較高的靈敏度，適用于低豐度蛋白的檢測(cè)。如果樣品中目標(biāo)蛋白含量較高，對(duì)靈敏度要求不那么苛刻，AP 或熒光標(biāo)記的二抗也可能滿足需求。

3. 背景干擾：某些實(shí)驗(yàn)體系中可能存在背景干擾問題。HRP 標(biāo)記的二抗有時(shí)可能導(dǎo)致較高背景，此時(shí)可嘗試 AP 或熒光標(biāo)記的二抗，以降低背景。

4. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模喝绻枰瑫r(shí)檢測(cè)多個(gè)蛋白，熒光標(biāo)記的二抗可以通過不同的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)來區(qū)分不同的目標(biāo)蛋白。

5. 成本和便捷性：不同標(biāo)記物的二抗價(jià)格可能不同，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)相對(duì)較為簡(jiǎn)便和常用，而熒光檢測(cè)可能需要更復(fù)雜的儀器和操作。

轉(zhuǎn)自：SCI網(wǎng)

主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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