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最近經(jīng)常聽到小伙伴們苦惱于流式結(jié)果不理想，這篇文章為大家總結(jié)了一系列流式實驗常見問題，看完絕對可以有效避坑（建議存入收藏夾備用）！

1. 無信號/熒光強度弱 

● 補償問題

多色流式配色很關(guān)鍵，低表達(dá)的抗原可以用相同熒光素的高表達(dá)抗原代替，或者使用補償微球。

● 用于檢測的抗體不足

一定要做抗體滴定，按照說明書的要求加抗體。

● 無法接近細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)

確定好抗原的表達(dá)位置，選擇合適的染色方法和刺激方法。

● 激光器未對齊

做實驗前一定要確保儀器沒有問題。流式細(xì)胞儀是流式的三大基本要素之一，要經(jīng)常維護儀器，做質(zhì)控，并清洗儀器。確保流式細(xì)胞儀上的激光器正確對齊，必要時通過運行液流檢查微珠來調(diào)整路線。如果激光器未正確對齊或發(fā)生偏移，則可能需要考慮維修機器。

● 靶蛋白不存在/低水平表達(dá)

確保您正在分析的組織/細(xì)胞類型能表達(dá)靶蛋白，并且靶蛋白的量足以被檢出。

● 細(xì)胞因子類marker

正常的淋巴細(xì)胞處于未激活狀態(tài)，不會分泌細(xì)胞因子。因此要選擇合適的方法激活淋巴細(xì)胞，使其釋放細(xì)胞因子，達(dá)到檢測水平。同時要加蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑使其留在胞內(nèi)，然后固定破膜，染相應(yīng)抗體。細(xì)胞刺激劑、蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑以及固定破膜的試劑的選擇都會影響染色結(jié)果。

● 熒光淬滅

抗體可能存放太久或沒有避光。還要考慮固定試劑的問題。

● 一抗和二抗不匹配

使用的二抗應(yīng)與一抗來源種屬不同（例如，一抗為兔源，則應(yīng)該使用抗兔源二抗）。為了解決種屬交叉反應(yīng)性的問題，您可以使用經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)驗證的直接偶聯(lián)一抗，或者使用偶聯(lián)物試劑盒，在您選擇的抗體中加入合適的熒光染料。

2. 熒光強度高

● 抗體濃度過高

做抗體滴定。

● 過量抗體被捕獲

胞內(nèi)染色特有的問題。染色后，充分清洗。也有可能是破膜劑的問題，破膜不夠充分。

● 無法接近細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)

確定好抗原的表達(dá)位置，選擇合適的染色方法和刺激方法。

● 封閉不足

做Fc受體阻斷是一個特別好的流式習(xí)慣，但不是所有的細(xì)胞都需要做封閉，做封閉是為了減少非特異性結(jié)合。

3. 背景高/陽性細(xì)胞百分比高

● 增益設(shè)置過高/補償過低

使用陽性對照正確設(shè)置流式細(xì)胞儀，使用補償減少小顆粒背景信號并減少增益，以降低信號。

● 抗體過量

抗體滴定。清洗充分。

4. 在應(yīng)該只有1個細(xì)胞群時觀察到2個或以上

● 表達(dá)目的marker的細(xì)胞群不止一個

做實驗前要確定好目的細(xì)胞的目的marker。

● 出現(xiàn)細(xì)胞雙峰

細(xì)胞雙峰顯示為第二大細(xì)胞群，其熒光強度大約是單細(xì)胞熒光強度的兩倍。制樣和上機的過程要確保是單細(xì)胞懸液，并且過濾掉大的組織團塊。

一定要做抗體滴定，按照說明書的要求加抗體。

5. 側(cè)向散射背景偏高（來自小顆粒）

● 細(xì)胞裂解

制樣問題，保證細(xì)胞的活力，不能有太多碎片。注意離心條件和渦旋力度。

● 細(xì)菌污染

確保樣本不受污染。細(xì)菌會自動發(fā)出較弱的熒光，導(dǎo)致高事件率。

● 去死活

樣本制備不可避免的會出現(xiàn)細(xì)胞死亡或壞死，特別是實體組織制備的單細(xì)胞懸液，一定要染死活，不染自發(fā)熒光會很高，干擾實驗結(jié)果。

6. 其他

● 細(xì)胞量

正常1×106個細(xì)胞/100 μL體系中染色。表達(dá)量高的膜表面分子可以體系減半抗體減半。固定破膜的過程中，會損失掉一些細(xì)胞。因此，表達(dá)量低、胞內(nèi)、核內(nèi)分子可以加大細(xì)胞量，相應(yīng)體積的抗體也可以對應(yīng)細(xì)胞量多加，一定要做預(yù)實驗和抗體滴定，摸索最佳染色效果。

● 電壓

裸細(xì)胞調(diào)完FSC、SSC的電壓，記得調(diào)熒光通道的電壓。

● 對照

一定要設(shè)置好對照組，補償對照、陰性對照、陽性對照（生物學(xué)對照）、同型對照、FMO對照。

● 細(xì)胞聚集，阻塞管道

制樣的過程中一定要確保是單細(xì)胞懸液，制樣和上機的時候過濾掉組織團塊。

● 固定

某些熒光素對多聚甲醛敏感，要注意，可以選擇成品、溫和的固定液。如果固定過夜，上機前要清洗掉多聚甲醛再上機。

最后提醒大家：一定要做預(yù)實驗和抗體滴定，把所有的對照都設(shè)置好，預(yù)實驗盡可能排除掉所有可能出現(xiàn)的問題，穩(wěn)定條件，甚至可以再流式細(xì)胞儀上設(shè)好panel，再上大規(guī)模的實驗！

主營項目

1. 動物實驗

動物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動生化檢測等

2. 細(xì)胞實驗

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實驗、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等

4. 蛋白實驗

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實驗

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實驗

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實驗

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實驗

方案設(shè)計、整體實驗交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

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康旭禾生物提供包括動物實驗、細(xì)胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關(guān)的各項服務(wù)。

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