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流式細(xì)胞儀通常配有多個(gè)激光器，它們產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光。由于每種熒光染料發(fā)出的光通常結(jié)合長(zhǎng)通或短通濾光片被帶通濾光片過(guò)濾，故流式細(xì)胞儀只檢測(cè)特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光。在選擇熒光染料時(shí)，請(qǐng)確認(rèn)儀器帶有能夠激發(fā)目標(biāo)熒光染料的激光器，以及能夠檢測(cè)該染料發(fā)射光的濾光片組合。

抗體選擇/多色組合設(shè)計(jì)

一般來(lái)說(shuō)，在同一樣品上使用的熒光染料越多，從該樣品中收集到的信息也越多。在單個(gè)樣品上組合使用多種熒光染料時(shí)，設(shè)計(jì)需要遵循以下幾點(diǎn)基本建議：

<10種顏色

1.抗原密度*應(yīng)該與熒光染料亮度相匹配

◆最重要的是，低密度或難以檢測(cè)的標(biāo)志物應(yīng)該與明亮的熒光染料配對(duì)。

◆高密度的標(biāo)志物與中等或暗淡的熒光染料配對(duì)。

2.選擇跨通道的熒光染料，最大限度減少熒光溢漏。

3.測(cè)試！

>10種顏色

1.讓低表達(dá)豐度的標(biāo)志物與明亮的熒光染料相匹配。

2.最大限度減少溢漏，特別是低表達(dá)抗原。

3.利用溢漏擴(kuò)散矩陣(SSM)**來(lái)確定哪些通道的分辨率可能受到影響。

4.對(duì)于相互排斥的抗原(同一類細(xì)胞上不會(huì)同時(shí)表達(dá)的抗原),將次優(yōu)的熒光染料組合留給它們。

5.測(cè)試！

*什么是抗原密度？

抗原密度指的是蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞上的表達(dá)水平(詳見(jiàn)下圖)，這是在多色設(shè)計(jì)時(shí)的一個(gè)重要考慮因素。為了確保能被檢測(cè)到，低水平表達(dá)的抗原、細(xì)胞內(nèi)抗原或連續(xù)表達(dá)（非誘導(dǎo)）的抗原應(yīng)當(dāng)與最明亮的熒光染料配對(duì)。抗原密度和預(yù)期表達(dá)模式可在網(wǎng)上或文獻(xiàn)中查到。

**溢漏與溢漏擴(kuò)散之間有何差異？

溢漏是指熒光染料的信號(hào)“溢出”到其他的檢測(cè)器。這是由熒光染料發(fā)射和儀器光學(xué)設(shè)置產(chǎn)生的問(wèn)題。如下圖所示，綠色信號(hào)（AF488）除在FITC濾光片（515-545nm）中檢測(cè)到。也在鄰近的PE濾光片（564-606nm）中檢測(cè)到。這種溢漏可通過(guò)補(bǔ)償來(lái)校正。

溢漏擴(kuò)散是因多個(gè)熒光染料溢出到每個(gè)檢測(cè)器而導(dǎo)致的測(cè)量誤差，這引起某些通道的分辨率降低。

1隨著實(shí)驗(yàn)中熒光染料的數(shù)量不斷增加，溢漏擴(kuò)散變得影響更大，并且熒光越亮，擴(kuò)散越大。通過(guò)建立溢漏擴(kuò)散矩陣（SSM）可識(shí)別哪些通道可能出現(xiàn)溢漏擴(kuò)散的問(wèn)題。一般來(lái)說(shuō)應(yīng)避免暗淡信號(hào)受到這種現(xiàn)象的影響。

在下圖的例子中，2號(hào)檢測(cè)器的熒光擴(kuò)散到1號(hào)檢測(cè)器，隨著2號(hào)檢測(cè)器的信號(hào)增強(qiáng)，擴(kuò)散也增大。因此，如果要分析1號(hào)檢測(cè)器中的低表達(dá)抗原（淺灰色圓圈）和2號(hào)檢測(cè)器中的高表達(dá)抗原（橙色），低表達(dá)抗原的檢測(cè)會(huì)受到影響。

實(shí)驗(yàn)對(duì)照

流式細(xì)胞術(shù)的對(duì)照可分為五大類2：

儀器對(duì)照

儀器對(duì)照是通過(guò)追蹤激光器、檢測(cè)器和流體性能，從而確認(rèn)儀器是否正常工作3。一般來(lái)說(shuō)，這些對(duì)照涉及到儀器制造商提供或出售的校準(zhǔn)顆?；驘晒馕⑶?。這些質(zhì)量控制微球應(yīng)在儀器運(yùn)行的每一天使用。

補(bǔ)償對(duì)照

當(dāng)熒光染料之間的發(fā)射光譜重疊時(shí)，這些信號(hào)會(huì)擴(kuò)散到多個(gè)通道。校正溢漏的過(guò)程被稱為補(bǔ)償4。補(bǔ)償可確保檢測(cè)器只計(jì)算該通道特定的熒光發(fā)射光（圖1）。補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)需要每種熒光染料的單染樣品（每個(gè)樣品只染一種染料）。這些可以利用細(xì)胞、補(bǔ)償微球或抗體捕獲微球*來(lái)設(shè)置。在創(chuàng)建補(bǔ)償對(duì)照時(shí)，請(qǐng)注意四個(gè)基本原則：

圖1.未補(bǔ)償vs.補(bǔ)償?shù)臄?shù)據(jù)。利用CD3/CD28抗體刺激人CD3+T細(xì)胞7天。利用hCD4A700抗體（R&DSystems貨號(hào)FAB3791N）和hCD25APC抗體（R&DSystems貨號(hào)FAB1020A）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。圖中顯示了未補(bǔ)償（a）和補(bǔ)償（b）的hCD4和hCD25的散點(diǎn)圖。

①補(bǔ)償熒光染料必須與實(shí)驗(yàn)熒光染料完全匹配。

◆同一通道內(nèi)的熒光染料仍具有不同的發(fā)射光譜，并且不可互換。例如，F(xiàn)ITC不能作為GFP的補(bǔ)償對(duì)照。

◆由于復(fù)合染料的差異，實(shí)驗(yàn)中的復(fù)合染料標(biāo)記抗體應(yīng)當(dāng)與補(bǔ)償計(jì)算所用的抗體完全相同（來(lái)自同一支抗體）。使用相同的復(fù)合熒光染料偶聯(lián)不同的抗體、甚至僅是不同批次抗體，都可能會(huì)導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果不準(zhǔn)確。

②補(bǔ)對(duì)照的亮度必須與實(shí)驗(yàn)樣品相同或更高。

③對(duì)于任何對(duì)照，陰性和陽(yáng)性群體的自發(fā)熒光必須相同。最好的做法是單獨(dú)為每個(gè)通道的陽(yáng)性和陰性群設(shè)門，避免使用通用的陰性對(duì)照。

④收集足夠多的事件！補(bǔ)償依賴于熒光強(qiáng)度中位值的準(zhǔn)確計(jì)算，如果事件太少，將無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算。收集數(shù)量應(yīng)多于5000個(gè)。

*抗體捕獲微球與抗體重鏈結(jié)合,因此與生物樣品不同,不需要特異性抗原識(shí)別。作為實(shí)用性補(bǔ)償試劑,這些微球可提高補(bǔ)償?shù)囊恢滦?特別適用于:

●陽(yáng)性群體染色暗淡或稀少。補(bǔ)償微球具有強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，使得補(bǔ)償對(duì)照的亮度與實(shí) 驗(yàn)樣品相同或更高

●處理多種熒光染料

●樣品數(shù)量有限

設(shè)門對(duì)照

在分析流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)時(shí)，最關(guān)鍵的是正確設(shè)門。當(dāng)細(xì)胞群體無(wú)法清晰界定或比較稀少時(shí)，需要熒光減一對(duì)照（FluorescenceMinus One，F(xiàn)MO）來(lái)解釋流式數(shù)據(jù)并準(zhǔn)確設(shè)門。FMO對(duì)照能夠在多色實(shí)驗(yàn)中可靠評(píng)估背景，故它們能準(zhǔn)確區(qū)分陰性和陽(yáng)性細(xì)胞群體。

制備FMO對(duì)照是用所有熒光抗體染色細(xì)胞，但去掉某一種熒光抗體。例如，如果利用AF488、PE、APC和DAPI開(kāi)展四色實(shí)驗(yàn)，那么FMO對(duì)照可按照下表來(lái)設(shè)置：

特異性染色體對(duì)照

抗體與細(xì)胞結(jié)合有三種基本形式：

a.Fab區(qū)域與抗原結(jié)合（理想情況）

b.Fc區(qū)域與Fc受體結(jié)合（通常不想要）

c.非特異性結(jié)合（脫靶抗原、“粘”住細(xì)胞膜等）

在各種流式細(xì)胞術(shù)分析中，避免非特異性結(jié)合的最佳方法有:

a.正確滴定所有的試劑

b.封閉細(xì)胞的Fc受體

c.加入一種細(xì)胞活性染料以排除死細(xì)胞

? 什么是同型對(duì)照？

同型對(duì)照可用于評(píng)估因抗體類別引起的非特異性結(jié)合。同型對(duì)照是指與一抗的類別、亞型和熒光標(biāo)記物一致但對(duì)目標(biāo)靶點(diǎn)無(wú)特異性結(jié)合的抗體。通過(guò)檢測(cè)背景染色，同型對(duì)照可以指示實(shí)驗(yàn)步驟是否需要進(jìn)一步優(yōu)化。同型對(duì)照可用于確定：

◆細(xì)胞是否充分封閉：如果未完全封閉，同型對(duì)照將與Fc受體結(jié)合。如果非特異性結(jié)合的原因在于細(xì)胞存在“粘性”，特別是死細(xì)胞的存在，則可在染色液中加入DNA酶。

◆胞內(nèi)指標(biāo)染色期間是否充分洗滌：針對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的抗體即使不與抗原結(jié)合，也常常會(huì)出現(xiàn)被攔在細(xì)胞內(nèi)。

同型對(duì)照一直是流式細(xì)胞術(shù)中最常用的陰性對(duì)照之一。但是，完全匹配的同型對(duì)照必須與待測(cè)抗體有著相同的免疫球蛋白重鏈和輕鏈，而且熒光染料與抗體的偶聯(lián)比例也相同。在同型對(duì)照不滿足這些要求的情況下，用戶必須小心背景染色的過(guò)度解讀2,5。對(duì)于多色流式組合，同型對(duì)照無(wú)法解釋其他通道中的試劑所引起的背景熒光。FMO對(duì)照可以用來(lái)評(píng)估這種背景信號(hào)。

? 什么是同抗對(duì)照

同抗對(duì)照（Isoclonic）是指添加過(guò)量的未標(biāo)記抗體，以檢測(cè)非特異性結(jié)合。如果抗體是特異性的，那么過(guò)量的未標(biāo)記抗體將導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低。熒光若沒(méi)有減少，則表明非特異性結(jié)合的存在。

實(shí)驗(yàn)對(duì)照

實(shí)驗(yàn)對(duì)照分為幾個(gè)主要類別：

?生物學(xué)陰性對(duì)照用于提供所有待測(cè)標(biāo)志物的表達(dá)背景。在比較細(xì)胞經(jīng)過(guò)化學(xué)或生物學(xué)處理后的蛋白質(zhì)表達(dá)差異時(shí)，這種對(duì)照特別重要（圖2）。

?生物學(xué)陽(yáng)性對(duì)照用于證實(shí)抗體在相關(guān)細(xì)胞中的陽(yáng)性染色，以表明抗體在實(shí)驗(yàn)中起作用。

?縱向?qū)φ?參考對(duì)照是長(zhǎng)期研究的質(zhì)量控制，可以確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的染色一致性。

圖2.誘導(dǎo)標(biāo)志物的陰性對(duì)照。Jurkat細(xì)胞未經(jīng)處理(a),或經(jīng)過(guò)50uM氯喹(TocrisBioscience貨號(hào)4109)處理24小時(shí)（b）。利用LC3B(1251A)抗體(NovusBiologicals貨號(hào)NBP2-46892，藍(lán)色)和匹配的同型對(duì)照(R&DSystems貨號(hào)MAB1050，橙色)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。用4%甲醛固定細(xì)胞,之后用0.1%皂苷透化細(xì)胞。與1ug/mL的抗體室溫孵育30分鐘，然后加入APC標(biāo)記的兔IgG二抗（R&DSystems貨號(hào)F0111）。

01樣本制備

各種來(lái)源的樣品準(zhǔn)備進(jìn)行流式分析時(shí)需制備成單顆粒懸液，以分析活細(xì)胞或固定細(xì)胞、細(xì)胞核、微生物或小顆粒，具體取決于分析目標(biāo)。擁有或開(kāi)發(fā)一個(gè)好的樣品制備方案，將為實(shí)驗(yàn)成功打下基礎(chǔ)。在制備單細(xì)胞懸液時(shí)，主要的考慮因素是盡量減少細(xì)胞死亡和碎片。死細(xì)胞導(dǎo)致樣品中岀現(xiàn)團(tuán)塊，這些團(tuán)塊往往在免疫染色中粘附游離的抗體，且表現(xiàn)岀更高水平的自發(fā)熒光，從而干擾熒光的準(zhǔn)確測(cè)定。制備過(guò)程中的碎片過(guò)多則會(huì)提高噪音水平，如果過(guò)量還會(huì)干擾目標(biāo)細(xì)胞的測(cè)定。

盡管流式細(xì)胞術(shù)沒(méi)有神奇的訣竅（岀自HowardShapiro的流式細(xì)胞術(shù)第零定律），樣品制備是可以通過(guò)以下步驟來(lái)優(yōu)化：

1.獲得并保持單細(xì)胞懸液。

(1）過(guò)濾器是從樣品中去除團(tuán)塊的好工具。建議從40μm過(guò)濾器開(kāi)始。

(2）某些染色液添加劑可減少細(xì)胞成團(tuán)。

a.EDTA（~1-5mM）可減少陽(yáng)離子依賴性細(xì)胞粘附。

b.DNA酶（~0.1mg/mL）能降解死細(xì)胞的DNA，并減少細(xì)胞粘附。

(3）從整個(gè)組織中獲得細(xì)胞群體可能頗具挑戰(zhàn)性。通常用膠原酶和胰蛋白酶來(lái)分解組織和解離細(xì)胞。避免過(guò)度消化，這會(huì)破壞目標(biāo)抗原表位或影響細(xì)胞活力。

2.了解生物樣品并保持細(xì)胞活力，細(xì)胞制備的標(biāo)準(zhǔn)方案將取決于細(xì)胞來(lái)源。

(1）將細(xì)胞置于冰上并使用預(yù)冷的緩沖液，有助于維持某些細(xì)胞的活力。（注意：這未必適用于所有細(xì)胞或所有應(yīng)用?。?/p>

(2）盡量減少處理時(shí)間、渦旋振蕩、離心速度及次數(shù)，所有這些都會(huì)影響細(xì)胞活力。例如，外周血、淋巴組織和培養(yǎng)細(xì)胞在制備單細(xì)胞懸液時(shí)不要使用劇烈的處理方法。

(3）在固定之前，盡可能快地處理細(xì)胞，以便減少實(shí)驗(yàn)假象和細(xì)胞死亡。

(4）考慮在染色緩沖液中加入HEPES，增加CO2的緩沖。

(5）了解細(xì)胞的大小以及它們是否表達(dá)任何熒光蛋白或是否具有任何熒光特性。

02樣品染色

設(shè)計(jì)流式細(xì)胞術(shù)的方案和檢測(cè)流程時(shí)，由于有許多變量需要優(yōu)化而需要進(jìn)行一些問(wèn)題排查。在開(kāi)始新的流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，最好在各種條件下進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以便優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程。在研究不同細(xì)胞或分析不同抗原時(shí)，實(shí)驗(yàn)方案和染色條件也許不能直接套用?？贵w孵育的時(shí)間和溫度可能影響受體染色，此步驟需要進(jìn)一步優(yōu)化（圖3）。

圖3.溫度對(duì)染色的影響。只有在最佳染色條件下，CCR7表位才能染上。在4°C下細(xì)胞產(chǎn)生了低的CCR7信號(hào)。在相同的細(xì)胞制備條件下，隨著抗體孵育溫度升高至室溫和37°C，CCR7的檢測(cè)（R&DSystems貨號(hào)FAB197A）得到改善。盡管CCR7染色在37°C時(shí)最為理想，但其他受體的檢測(cè)也許在4°C時(shí)最佳。

抗圖片體生產(chǎn)商通常利用固定數(shù)量的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行抗體稀釋，如每個(gè)樣品有100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。這對(duì)于低密度標(biāo)志物如CD127而言尤其重要，因?yàn)榧?xì)胞數(shù)量對(duì)染色有相當(dāng)大的影響（圖4）。

圖4.細(xì)胞密度對(duì)染色的影響。不同細(xì)胞量的CD127+T細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定濃度的CD127APC抗體（R&DSystems 貨號(hào)FAB306A）染色。100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞染色效果最佳，超過(guò)200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的染色會(huì)導(dǎo)致信號(hào)減弱。這種損失是因?yàn)榭贵w稀釋過(guò)度，無(wú)法與所有的抗原表位結(jié)合而導(dǎo)致的。

優(yōu)化樣品染色條件的更多建議:

1.每次都加入鑒定細(xì)胞活力的染料。

2.滴定每批試劑,以實(shí)現(xiàn)最佳的信噪比(一抗、二抗、活力染料等)。在右側(cè)的例子中,1:10的稀釋顯示了最佳的信噪比。

3.細(xì)胞內(nèi)染色還有一些特殊的考慮因素。

  (1）在染色細(xì)胞內(nèi)蛋白時(shí)，細(xì)胞懸液需要固定和透化，然后再加入抗體。這種固定和透化處理讓抗體穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，同時(shí)維持細(xì)胞分選所需用到的形態(tài)特征

（2）在對(duì)細(xì)胞因子等分泌蛋白進(jìn)行染色時(shí)，需要蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（莫能菌素或布雷菲德菌素A），將細(xì)胞因子保留在細(xì)胞內(nèi)。這些化合物通過(guò)破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，阻止新合成蛋白質(zhì)的輸出。對(duì)于刺激時(shí)間超過(guò)4-6小時(shí)的實(shí)驗(yàn)處理，分泌抑制劑可存在于整個(gè)孵育期內(nèi)。若刺激時(shí)間低于4-6小時(shí)，則分泌抑制劑應(yīng)在孵育的最后兩小時(shí)加入

（3）不要將復(fù)合染料用在胞內(nèi)蛋白染色上-這些偶聯(lián)物分子量大，較難穿透細(xì)胞膜以及從細(xì)胞中洗掉。

主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿