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01論文基本信息 

標(biāo)題：SH3RF3 promotes breast cancer stem-like properties via JNK activation and PTX3 upregulation

期刊：Nature Communications

影響因子：17.69

作者：Peiyuan Zhang, Yingjie Liu, Cheng Lian 等

發(fā)表日期：2020 年 5 月 19 日

DOI：10.1038/s41467-020-16051-9

關(guān)鍵詞：乳腺癌干細(xì)胞；SH3RF3；JNK 通路；PTX3

02研究背景 

癌癥嚴(yán)重威脅人類健康，腫瘤異質(zhì)性使得癌癥治療面臨挑戰(zhàn)，癌癥干細(xì)胞（CSCs）理論為解釋腫瘤異質(zhì)性提供了思路。乳腺癌干細(xì)胞（BCSCs）在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，目前對其調(diào)控機(jī)制的了解尚不完整。SH3RF3 是一種含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，其在癌癥中的功能尚未明確，PTX3 在癌癥中的作用存在爭議 。

03實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 

篩選關(guān)鍵分子

通過流式細(xì)胞術(shù)分選 HMLER 細(xì)胞系，得到具有不同 BCSC 特性的亞群，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析篩選與 BCSCs 相關(guān)的分子；分析公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，確定與臨床腫瘤 BCSC 特性相關(guān)的基因，并與細(xì)胞系數(shù)據(jù)交叉分析，篩選出關(guān)鍵基因 SH3RF3。

功能驗(yàn)證

構(gòu)建過表達(dá)和敲低 SH3RF3 的細(xì)胞模型，檢測 BCSCs 相關(guān)指標(biāo)（如 CD44+CD24 - 細(xì)胞比例、ALDH + 細(xì)胞比例、腫瘤球形成能力、體內(nèi)成瘤能力等），驗(yàn)證 SH3RF3 對 BCSCs 特性的影響；構(gòu)建過表達(dá)和敲低 PTX3 的細(xì)胞模型，檢測其對 BCSCs 特性的影響，并通過 rescue 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 PTX3 在 SH3RF3 調(diào)控 BCSCs 中的作用。

機(jī)制探究

運(yùn)用 RNA 測序、ChIP-qPCR、熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、Co-IP 等實(shí)驗(yàn)，探究 SH3RF3 調(diào)控 PTX3 表達(dá)的信號(hào)通路及分子機(jī)制；分析 SH3RF3 與 JNK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的相互作用，確定 SH3RF3 激活 JNK-JUN 通路的機(jī)制。

臨床相關(guān)性分析

培養(yǎng)患者來源的類器官，觀察 SH3RF3 過表達(dá)對其形成的影響；分析 TCGA 乳腺癌隊(duì)列、Qilu 隊(duì)列數(shù)據(jù)及 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫，探究 SH3RF3 表達(dá)與 BCSCs 特性、患者預(yù)后的相關(guān)性。

04實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖 1：SH3RF3 表達(dá)與 BCSC 特性相關(guān)

a：HMLER 亞系衍生流程圖及代表性圖像。比例尺，100μm。

b：HMLER 亞系中腫瘤球的定量分析（n=3 次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)）及代表性圖像。比例尺，100μm。

c：不同濃度紫杉醇（0 - 200ng/mL）和阿霉素（0 - 500nM）處理后，HMLER 亞系的 MTT 檢測結(jié)果（n=4 次處理實(shí)驗(yàn)）。

d：HMLER 亞系中 CD44+CD24 - 和 ALDH+ CSCs 的流式細(xì)胞術(shù)分析。圖中數(shù)字表示相應(yīng)亞群的百分比。

e：臨床腫瘤和 HMLER 亞系中與 CSC 特性相關(guān)的基因。熱圖展示了它們在 HMLER 亞系中的表達(dá)、與 TCGA 腫瘤中 CSC 特征的皮爾遜相關(guān)性（Corr_r）以及腫瘤球與原發(fā)腫瘤中表達(dá)的對數(shù)倍數(shù)變化（logFC）。

f：來自 HMLER、HMLE 和 MCF10AT 不同亞系中 SH3RF3 的表達(dá)（n=3 次細(xì)胞培養(yǎng)）。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。采用雙尾無配對 t 檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（b、c 和 f）。（b）和（f）中的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，結(jié)果相似，展示其中一次代表性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)

●細(xì)胞亞群分選及特性鑒定：通過流式細(xì)胞術(shù)將 HMLER 細(xì)胞系分為 CD44H（CD44+CD24-）和 CD44L（CD44-CD24+）亞群，對 CD44L 細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行腫瘤球培養(yǎng)獲得 CD44LS 亞群。CD44H 和 CD44LS 亞群的腫瘤球形成能力增強(qiáng)，對化療藥物（紫杉醇、阿霉素）耐藥性提高，且 CD44H 主要為 CD44+CD24-，CD44LS 細(xì)胞的 ALDH 表達(dá)更高，表明成功富集了具有不同 BCSC 特性的亞群。

●基因篩選與驗(yàn)證：對 CD44L、CD44H 和 CD44LS 進(jìn)行 RNA 測序，分析差異表達(dá)基因。結(jié)合 TCGA 乳腺癌隊(duì)列及患者來源腫瘤球與原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，篩選出 76 個(gè)與 CD44+CD24 - 特征和腫瘤球形成能力相關(guān)的基因，其中 21 個(gè)基因與 HMLER 亞系中鑒定的 CSC 相關(guān)基因重疊，SH3RF3 是其中之一。qRT-PCR 和 Western blot 分析證實(shí) SH3RF3 在多種細(xì)胞系的 BCSC 亞群（如 HMLER 的 CD44H 和 CD44LS、HMLE 和 MCF10AT 的 CD44+CD24 - 亞群）中表達(dá)上調(diào)。

圖 2：SH3RF3 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的 CSC 特性

a：HMLE、MCF10AT 和 MDA-MB-231 細(xì)胞中 SH3RF3 的過表達(dá)情況。

b：HMLE 和 MCF10AT 中 CD44+CD24 - 亞群以及 MDA-MB-231 中 ALDH + 亞群的流式細(xì)胞術(shù)分析。圖中數(shù)字表示 CSC 百分比（n=3 次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)）。

c：過表達(dá) SH3RF3 的乳腺癌細(xì)胞中腫瘤球形成的定量分析及代表性圖像（n=3 次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)）。比例尺，100μm。

d：在第 28 天，注射連續(xù)稀釋的 MDA-MB-231 細(xì)胞的小鼠體內(nèi)腫瘤形成情況。

e：注射 40 個(gè)對照和過表達(dá) SH3RF3 的 MDA-MB-231 細(xì)胞的小鼠的腫瘤圖像和體積（n=10 只小鼠）。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。采用雙尾無配對 t 檢驗(yàn)（b 和 c）、卡方檢驗(yàn)（d）或 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)（e）確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（a）、（b）（上）和（c）中的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，結(jié)果相似，展示其中一次代表性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。

●細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)：在 HMLE、MCF10AT 和 MDA-MB-231 細(xì)胞中過表達(dá) SH3RF3，結(jié)果顯示 CD44+CD24 - 細(xì)胞在 HMLE 和 MCF10AT 中比例增加，MDA-MB-231 中 ALDH + 亞群增多，且這三種細(xì)胞系的腫瘤球形成能力均顯著增強(qiáng)。在小鼠乳腺癌細(xì)胞系 Py8119 中，Sh3rf3 在 ALDH + 亞群中表達(dá)上調(diào)，過表達(dá) Sh3rf3 也增強(qiáng)了其腫瘤球形成能力。

●體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)：將過表達(dá) SH3RF3 的 MDA-MB-231 細(xì)胞和對照細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋后原位移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)。當(dāng)注射較少細(xì)胞（如 40 個(gè)細(xì)胞）時(shí)，過表達(dá)組小鼠的腫瘤發(fā)生率更高，腫瘤體積更大，CSC 頻率顯著增加；在 HMLER 細(xì)胞中過表達(dá) SH3RF3 也得到類似結(jié)果，表明 SH3RF3 過表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)的腫瘤起始能力。

圖 3：SH3RF3 敲低損害乳腺癌細(xì)胞的 CSC 特性

a：HMLER-CD44H 和 MCF10CA1h 細(xì)胞中 SH3RF3 的敲低情況。

b：HMLER-CD44H 中 CD44high 亞群和 MCF10CA1h 中 ALDH + 亞群的流式細(xì)胞術(shù)分析（n=3 次細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)）。

c：敲低 SH3RF3 的乳腺癌細(xì)胞中腫瘤球形成的定量分析及代表性圖像（n=3 次球培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)）。比例尺，100μm。

d：在第 42 天，注射連續(xù)稀釋的 MCF10CA1h 細(xì)胞的小鼠體內(nèi)腫瘤形成情況。

e：注射 200 個(gè)對照或敲低 SH3RF3 的 MCF10CA1h 細(xì)胞的小鼠的腫瘤圖像和體積（n=8 只小鼠）。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。采用雙尾無配對 t 檢驗(yàn)（b 和 c）、卡方檢驗(yàn)（d）或 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)（e）確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（a）、（b）（左）和（c）中的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，結(jié)果相似，展示其中一次代表性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。

●敲低效果驗(yàn)證：在 HMLER-CD44H 和 MCF10CA1h 細(xì)胞系中使用多種 siRNAs 或 shRNAs 敲低 SH3RF3，Western blot 結(jié)果顯示敲低效果顯著。

●功能影響：敲低 SH3RF3 后，HMLER-CD44H 細(xì)胞中 CD44 高表達(dá)亞群比例明顯下降，MCF10CA1h 細(xì)胞中 ALDH + 亞群顯著減少，兩種細(xì)胞系的腫瘤球形成能力均受損。

●體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：對敲低 SH3RF3 的 MCF10CA1h 細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋后原位移植到小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示敲低組小鼠的腫瘤起始能力顯著降低，腫瘤體積更小，表明 SH3RF3 對維持乳腺癌細(xì)胞的 CSC 特性至關(guān)重要。

圖 4：PTX3 受 SH3RF3 調(diào)控并增強(qiáng) BCSC 特性

a：HMLER 亞系中差異表達(dá)且受 SH3RF3 過表達(dá)調(diào)控的基因的表達(dá)熱圖。

b：過表達(dá)和敲低 SH3RF3 后，不同癌細(xì)胞系中 PTX3 mRNA 表達(dá)及其細(xì)胞外蛋白水平（n=3 次細(xì)胞培養(yǎng)）。

c：乳腺癌細(xì)胞系中 SH3RF3 和 PTX3 mRNA 水平的相關(guān)性（n=51 個(gè)細(xì)胞系）。

d：過表達(dá) PTX3 和對照的 HMLE 細(xì)胞條件培養(yǎng)基中細(xì)胞外 PTX3 水平。

e：過表達(dá) PTX3 后 HMLE 細(xì)胞的腫瘤球形成情況（n=3 次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)）。

f、g：過表達(dá) PTX3 和對照的 HMLE 細(xì)胞中 CD44+CD24- CSC 亞群的流式細(xì)胞術(shù)分析（f）和定量分析（g）。比例尺，100μm；n=3 次細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

h：注射不同數(shù)量 HMLER 細(xì)胞的小鼠在第 90 天的腫瘤發(fā)生率。

i：過表達(dá) PTX3 與對照細(xì)胞中 CSC 和 MaSC 相關(guān)基因集的 GSEA 分析。

j：過表達(dá) PTX3 與對照細(xì)胞中 Hedgehog 和 Hippo 調(diào)控基因集的 GSEA 分析。

k：過表達(dá) PTX3 后 Hedgehog 和 Hippo 調(diào)控基因的 mRNA 水平（n=3 次細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)）。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。采用配對 t 檢驗(yàn)（c）或雙尾無配對 t 檢驗(yàn)（e、g 和 k）確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（b）、（d）、（e）、（f）和（k）中的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，結(jié)果相似，展示其中一次代表性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。

●篩選與驗(yàn)證：對過表達(dá) SH3RF3 的 MCF10AT 細(xì)胞進(jìn)行 RNA 測序，與 HMLER 亞系差異表達(dá)基因重疊分析后，確定 PTX3 為關(guān)鍵基因。過表達(dá)和敲低 SH3RF3 實(shí)驗(yàn)表明，PTX3 在 RNA 和蛋白質(zhì)水平受 SH3RF3 調(diào)控。分析癌細(xì)胞系表達(dá)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，SH3RF3 和 PTX3 在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)呈強(qiáng)正相關(guān)。

●PTX3 功能驗(yàn)證：在 HMLE、HMLER 和 MCF10AT 細(xì)胞中過表達(dá) PTX3，細(xì)胞的腫瘤球形成能力增強(qiáng)，HMLE 中 CD44+CD24 - 亞群比例增加，HMLER 的體內(nèi)成瘤能力提高。

●通路分析：對過表達(dá) PTX3 的 HMLER 細(xì)胞進(jìn)行 RNA 測序和 GSEA 分析，發(fā)現(xiàn)與 CSC 和乳腺干細(xì)胞（MaSC）相關(guān)的基因集在過表達(dá) PTX3 的細(xì)胞中顯著富集，同時(shí) Hedgehog 和 YAP 信號(hào)通路相關(guān)基因集也顯著富集，qRT-PCR 驗(yàn)證了相關(guān)基因的上調(diào)，表明 PTX3 可能通過調(diào)控這些通路發(fā)揮作用。

圖 5：PTX3 介導(dǎo) SH3RF3 在 BCSC 調(diào)控中的功能

a：乳腺癌細(xì)胞系中，PTX3 和 SH3RF3 過表達(dá)后調(diào)控的基因集的 ssGSEA 得分的相關(guān)性（n=51 個(gè)細(xì)胞系）。

b：過表達(dá) PTX3 與對照細(xì)胞中 CD44 或 YAP 相關(guān)基因集的 GSEA 分析。

c：PTX3 和 SH3RF3 過表達(dá)后 Hedgehog 和 Hippo 調(diào)控基因的表達(dá)熱圖。

d：過表達(dá) SH3RF3 的 MDA-MB-231 細(xì)胞中 PTX3 的敲低情況。

e：過表達(dá) SH3RF3 且敲低 PTX3 的 MDA-MB-231 細(xì)胞中 ALDH + 亞群的流式細(xì)胞術(shù)分析。

f：過表達(dá) SH3RF3 且敲低 PTX3 的 MDA-MB-231 細(xì)胞中 ALDH+ CSC 亞群的定量分析（n=4 次 FACS 實(shí)驗(yàn)）。

g：過表達(dá) SH3RF3 且敲低 PTX3 的 MDA-MB-231 細(xì)胞中腫瘤球定量分析（n=3 次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)）。

h：在第 28 天，注射 40 個(gè) MDA-MB-231 細(xì)胞的小鼠的腫瘤起始情況。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差，n=3。采用配對 t 檢驗(yàn)（a）或雙尾無配對 t 檢驗(yàn)（f 和 g）確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（d）、（e）和（g）中的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，結(jié)果相似，展示其中一次代表性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。

●轉(zhuǎn)錄組相關(guān)性分析：ssGSEA 分析顯示，在乳腺癌細(xì)胞系中，SH3RF3 和 PTX3 過表達(dá)調(diào)控的基因集的 ssGSEA 得分具有強(qiáng)相關(guān)性，且 PTX3 過表達(dá)細(xì)胞中富集的基因集在 SH3RF3 過表達(dá)時(shí)也顯著富集，同時(shí) SH3RF3 過表達(dá)也調(diào)控了 PTX3 調(diào)節(jié)的 Hedgehog 和 Hippo-YAP 下游基因，表明兩者對癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響一致，尤其在與癌癥干性相關(guān)基因方面。

●rescue 實(shí)驗(yàn)：在 MDA-MB-231 細(xì)胞中敲低 PTX3，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，SH3RF3 過表達(dá)引起的 ALDH+ CSC 亞群擴(kuò)張被抑制，腫瘤球形成能力也受到顯著抑制。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，敲低 PTX3 抑制了 SH3RF3 過表達(dá)對 MDA-MB-231 細(xì)胞體內(nèi)成瘤的促進(jìn)作用，表明 PTX3 在 SH3RF3 調(diào)控 BCSCs 中起關(guān)鍵介導(dǎo)作用。

圖 6：SH3RF3 通過 JNK-JUN 通路增強(qiáng) PTX3 表達(dá)

a、b：用 JNK（SP600125，5nM）、WNT（XAV939，5nM）和 NF-κB（BAY11-7082，5nM）抑制劑處理過表達(dá) SH3RF3 和對照的 HMLE 細(xì)胞后，PTX3 表達(dá)（a）和腫瘤球形成（b，n=3 次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)）情況。

c、d：用 JNK 抑制劑處理過表達(dá) SH3RF3 和對照的 MDA-MB-231 細(xì)胞后，PTX3 表達(dá)（c）和腫瘤球形成（d，n=3 次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)）情況。

e：過表達(dá)和敲低 SH3RF3 后 JNK 和 JUN 的磷酸化情況。

f：過表達(dá) SH3RF3 后 HMLE 中 JUN 靶基因的表達(dá)（n=3 次 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)）。

g：HeLa 細(xì)胞中 JUN 與 PTX3 啟動(dòng)子結(jié)合的 ChIP-qPCR 分析（n=3 次 ChIP 實(shí)驗(yàn)）。

h：JUN 過表達(dá)和對照的 HeLa 細(xì)胞中 PTX3 啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告分析（n=3 次報(bào)告實(shí)驗(yàn)）。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。采用雙尾無配對 t 檢驗(yàn)（a、b、d、f、g 和 h）確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（a - f）和（g）中的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，結(jié)果相似，展示其中一次代表性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。

●通路篩選：用 PI3K、JNK、WNT 和 NF-κB 通路抑制劑處理 HMLE 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) JNK 抑制劑（SP600125）能顯著抑制 PTX3 表達(dá)和腫瘤球形成，消除 SH3RF3 的促進(jìn)作用，而 PI3K 抑制劑雖抑制 PTX3 表達(dá)，但 SH3RF3 仍能上調(diào) PTX3 表達(dá)和促進(jìn)腫瘤球形成，且 SH3RF3 不影響 AKT 磷酸化，表明 SH3RF3 通過 PI3K 非依賴途徑調(diào)控 PTX3。

●JNK 通路激活驗(yàn)證：在多種細(xì)胞系中過表達(dá) SH3RF3，JNK1、JNK2 及下游轉(zhuǎn)錄因子 JUN 的磷酸化水平增加；敲低 SH3RF3 則抑制 JNK 和 JUN 的磷酸化。同時(shí)，過表達(dá) SH3RF3 使已知的 JUN 靶基因（如 MMP3、CD44 等）顯著上調(diào)。

●JUN 與 PTX3 關(guān)系驗(yàn)證：ChIP-qPCR 實(shí)驗(yàn)證實(shí) JUN 能結(jié)合 PTX3 啟動(dòng)子，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明 JUN 可直接激活 PTX3 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，且 JUN 主要靶向 PTX3 啟動(dòng)子的 - 206 到 + 52 區(qū)域，該區(qū)域的三個(gè) AP-1 結(jié)合位點(diǎn)對 JUN 調(diào)控 PTX3 表達(dá)至關(guān)重要。

圖 7：SH3RF3 通過與 MKK 和 JNK 相互作用激活 JUN

a：293T 細(xì)胞中 SH3RF3 與 JNK1/2 相互作用的 Co-IP 分析。

b：293T 細(xì)胞中 SH3RF3 與 MKK4/7 相互作用的 Co-IP 分析。

c：293T 細(xì)胞中 SH3RF3 與 JIP3 相互作用的 Co-IP 分析。

d：293T 細(xì)胞中 SH3RF3-JIP3-MKK7 相互作用的順序 Co-IP 分析。

e：MCF10AT 中 JIP3 與 MKK7 相互作用的 Co-IP 分析（上），以及過表達(dá) SH3RF3 與否的情況（下）。

f：敲低 JIP3 與否的 MCF10AT 中 SH3RF3 與 JNK1/2 相互作用的 Co-IP 分析。

g：過表達(dá) SH3RF3 和敲低 JIP3 后 MCF10AT 中 JUN 的磷酸化情況。

h：不同 SH3RF3 截?cái)囿w與 MKK7、JIP3 和 JNK1 相互作用的 Co-IP 分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，結(jié)果相似，展示其中一次代表性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。

●相互作用驗(yàn)證：Co-IP 實(shí)驗(yàn)表明 SH3RF3 與 JNK1、JNK2 以及 MKK4、MKK7 存在相互作用，同時(shí) SH3RF3 能與 JIP 家族成員 JIP1、JIP2、JIP3 相互作用，在乳腺癌細(xì)胞 MCF10AT 中主要表達(dá) JIP3，且 SH3RF3、MKK7 和 JIP3 存在于同一復(fù)合物中。

● 作用機(jī)制探究：SH3RF3 增強(qiáng) JIP3 與 MKK7 的相互作用，但不影響 JIP3-JNK2 相互作用。敲低 JIP3 顯著削弱 SH3RF3 與 JNK 蛋白的結(jié)合以及 SH3RF3 促進(jìn) JUN 磷酸化的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SH3RF3 的第四個(gè) SH3 結(jié)構(gòu)域與 MKK7 相互作用，第一和第二個(gè) SH3 結(jié)構(gòu)域分別與 JIP3 和 JNK1 相互作用，表明 SH3RF3 通過促進(jìn) MKK-JNK 復(fù)合物的組裝激活 JNK-JUN 通路。

圖 8：SH3RF3 在人類乳腺腫瘤中的臨床相關(guān)性

a：過表達(dá) SH3RF3 后，人乳腺腫瘤 LTMBC-1 來源的患者類器官形成情況（n=3 次類器官培養(yǎng)重復(fù)）。（右圖）線表示中位數(shù)， whiskers 表示標(biāo)準(zhǔn)差。右圖展示了一個(gè)代表性類器官的蘇木精 - 伊紅染色。比例尺，100μm。

b：過表達(dá) SH3RF3 后，另外兩個(gè)人乳腺腫瘤（LTMBC-2 和 3）來源的患者類器官形成情況（n=3 次類器官培養(yǎng)重復(fù)）。

c：過表達(dá) SH3RF3 后，四個(gè)人胃癌（LTMGC-1、2、4 和 13）來源的患者類器官形成情況（n=3 次類器官培養(yǎng)重復(fù)）。比例尺，100μm。

d：TCGA 乳腺癌隊(duì)列中 SH3RF3 和 PTX3 表達(dá)與不同 CSC 標(biāo)記基因的相關(guān)性（n = 1097 例患者）。

e：TCGA 乳腺癌隊(duì)列中 SH3RF3 表達(dá)與 CSC 和 MaSC 相關(guān)基因集的 ssGSEA 得分的相關(guān)性（n = 1097 例患者）。

f：Qilu 隊(duì)列乳腺癌組織中 SH3RF3 和 CD44 的代表性 IF 圖像。比例尺，100μm。

g：Qilu 隊(duì)列中不同 SH3RF3 表達(dá)的乳腺癌組織中 CD44 表達(dá)水平（n = 40 例患者）。括號(hào)中的數(shù)字表示樣本量。

h：Qilu 隊(duì)列乳腺癌組織中 SH3RF3 和 CD44 IF 強(qiáng)度的相關(guān)性（n = 40）。

i：通過 Kaplan-Meier Plotter 乳腺癌隊(duì)列（n = 626 例患者）中 SH3RF3 表達(dá)進(jìn)行的生存分析。

j：SH3RF3 在 BCSC 調(diào)控中作用的示意圖模型。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。采用雙尾無配對 t 檢驗(yàn)（a、b 和 c）、卡方檢驗(yàn)（g）、配對 t 檢驗(yàn)（h）或雙側(cè)對數(shù)秩檢驗(yàn)（i）確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

●類器官實(shí)驗(yàn)：在患者來源的乳腺癌類器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá) SH3RF3 顯著增加了三個(gè)乳腺癌患者來源腫瘤細(xì)胞形成的類器官數(shù)量和大小，在胃癌類器官培養(yǎng)中也得到類似結(jié)果，表明 SH3RF3 促進(jìn)臨床腫瘤細(xì)胞的 CSC 特性。

●臨床數(shù)據(jù)分析：分析 TCGA 乳腺癌隊(duì)列 RNA 測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) SH3RF3 表達(dá)與 PTX3、CSC 標(biāo)記基因（CD44、ALDH1A1/2/3）呈正相關(guān)，且 SH3RF3 表達(dá)與 CSC 和 MaSC 相關(guān)基因集的富集正相關(guān)。

●免疫熒光分析：對 40 例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的 Qilu 隊(duì)列進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示 SH3RF3 表達(dá)越高，CD44 + 細(xì)胞數(shù)量越多，兩者信號(hào)強(qiáng)度呈正相關(guān)。

●預(yù)后分析：通過 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn) SH3RF3 高表達(dá)與乳腺癌患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加和生存率降低相關(guān)；在 CPTAC 乳腺癌隊(duì)列中，PTX3 高表達(dá)與疾病復(fù)發(fā)相關(guān)。

05研究結(jié)論 

SH3RF3 在乳腺癌干細(xì)胞中高表達(dá)，通過激活 JNK-JUN 通路上調(diào) PTX3 表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性，與臨床腫瘤的 CSC 富集和患者不良預(yù)后相關(guān)，為乳腺癌的治療提供了潛在的新靶點(diǎn)和理論依據(jù)，但 PTX3 下游分子機(jī)制及 SH3RF3 在 JNK 信號(hào)通路中的具體作用仍需進(jìn)一步研究 。

主營項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5.病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿

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