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以外泌體（或者胞外囊泡）及其成分（如RNA、脂質(zhì)和蛋白）、線粒體轉(zhuǎn)移（比如隧道納米管介導(dǎo)的）、配體-受體（比如膜配體、分泌性配體以及膜受體）為代表的“細(xì)胞-細(xì)胞間通訊（Cell-Cell Communication，CCC）”是很多研究團(tuán)隊(duì)關(guān)注的主題，也是這幾年國(guó)自然項(xiàng)目和高分文章經(jīng)常關(guān)注的領(lǐng)域。今天來(lái)盤(pán)點(diǎn)這三種作用方式的研究方法。

 01

外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊

外泌體是細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，攜帶蛋白質(zhì)、RNA等生物分子，通過(guò)與受體細(xì)胞融合或被內(nèi)吞，傳遞信號(hào)調(diào)節(jié)其功能。

研 究 方 法

（1）外泌體分離、鑒定和表征方法

外泌體分離常用差速超速離心、密度梯度超速離心、過(guò)濾、超濾等傳統(tǒng)方法，也可用微珠、微流控芯片等新技術(shù)。鑒定時(shí)需檢測(cè)外泌體的蛋白標(biāo)志物，如CD9、CD63、CD81等，常用Western blot。表征包括形態(tài)和粒徑分布，可使用透射電子顯微鏡（TEM）、納米顆粒跟蹤分析（NTA）等。

（2）外泌體示蹤細(xì)胞間傳遞方法

示蹤方法包括熒光染料標(biāo)記，如PKH26、PKH67等，可直接與外泌體脂質(zhì)雙層膜結(jié)合；核酸標(biāo)記，將外泌體核酸標(biāo)記為熒光或放射性探針；蛋白質(zhì)標(biāo)記，用GFP等標(biāo)記外泌體表面蛋白；還可利用磁性納米顆粒標(biāo)記，通過(guò)磁共振成像追蹤。

（3）外泌體成分的組學(xué)分析

外泌體組學(xué)分析主要包括蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)。蛋白質(zhì)組學(xué)通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)分析外泌體中的蛋白質(zhì)組成；轉(zhuǎn)錄組學(xué)利用高通量測(cè)序技術(shù)研究外泌體中的RNA種類(lèi)和表達(dá)水平；脂質(zhì)組學(xué)采用質(zhì)譜技術(shù)分析外泌體中的脂質(zhì)組成。

（4）外泌體與受體細(xì)胞共培養(yǎng)方法

將提取純化的外泌體加入受體細(xì)胞培養(yǎng)液中，通過(guò)觀察受體細(xì)胞的反應(yīng)和表型來(lái)研究外泌體對(duì)受體細(xì)胞的影響。此外，也可標(biāo)記外泌體后進(jìn)行共培養(yǎng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其在受體細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)變化。

 02

線粒體轉(zhuǎn)移

線粒體可通過(guò)隧道納米管（TNTs）、細(xì)胞外囊泡或直接細(xì)胞外釋放等方式從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞，支持受體細(xì)胞的代謝需求。

研 究 方 法

（1）線粒體分離和鑒定

線粒體分離通常采用差速離心法，先低速離心去除細(xì)胞碎片和核，再高速離心沉淀線粒體。鑒定方法包括透射電子顯微鏡（TEM）觀察其雙層膜結(jié)構(gòu)，以及通過(guò)特異性抗體（如抗TOM20抗體）進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

（2）分離線粒體后與細(xì)胞共培養(yǎng)

將分離的線粒體加入受體細(xì)胞培養(yǎng)液中，通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)觀察線粒體是否被攝取。也可利用化學(xué)誘導(dǎo)供體細(xì)胞線粒體耗竭后與受體細(xì)胞共培養(yǎng)，比較處理前后受體細(xì)胞的差異。

（3）細(xì)胞共培養(yǎng)體系下的線粒體標(biāo)記和示蹤

使用熒光染料（如MitoTracker）或熒光蛋白（如GFP）標(biāo)記供體細(xì)胞的線粒體，然后與受體細(xì)胞共培養(yǎng)。通過(guò)熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察線粒體在受體細(xì)胞中的分布，從而示蹤線粒體轉(zhuǎn)移。

（4）單細(xì)胞測(cè)序結(jié)合MERCI分析

獲取共培養(yǎng)的癌細(xì)胞和T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后，應(yīng)用MERCI算法識(shí)別線粒體突變（mtSNVs）并估計(jì)癌細(xì)胞中外源線粒體的相對(duì)豐度。通過(guò)比較突變頻率，確定T細(xì)胞特有的突變，將細(xì)胞分類(lèi)為潛在的線粒體供體和受體。并通過(guò)計(jì)算DNA和RNA排名分?jǐn)?shù)，預(yù)測(cè)線粒體的受體細(xì)胞和供體細(xì)胞。

 03

配體-受體結(jié)合

配體與受體結(jié)合后，誘導(dǎo)受體構(gòu)象變化，激活下游信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。

研 究 方 法

（1）阻斷性抗體阻斷受體活化

使用針對(duì)受體特定區(qū)域的阻斷性抗體，該抗體可特異性結(jié)合受體，阻止配體與受體結(jié)合，從而抑制受體的活化。通過(guò)檢測(cè)下游信號(hào)通路的激活情況（如蛋白磷酸化水平），評(píng)估阻斷效果，用于研究受體活化的功能和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。

（2）中和性抗體降低配體濃度

利用中和性抗體與配體特異性結(jié)合，形成抗體-配體復(fù)合物，從而降低游離配體的濃度。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)配體的反應(yīng)（如細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌等），評(píng)估中和效果，用于研究配體在生理過(guò)程中的作用和調(diào)控機(jī)制。

（3）配體-與受體在組織與細(xì)胞共培養(yǎng)體系下的染色與共定位

在共培養(yǎng)體系中，分別用熒光標(biāo)記的抗體對(duì)配體和受體進(jìn)行染色。通過(guò)熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察兩者的熒光信號(hào)，分析其共定位情況。共定位分析可借助軟件計(jì)算共定位系數(shù)，判斷配體與受體是否在同一細(xì)胞區(qū)域聚集，從而推斷二者在生理?xiàng)l件下的相互作用。

（4）免疫共沉淀驗(yàn)證配體-與受體結(jié)合

將細(xì)胞裂解后，加入針對(duì)受體的特異性抗體，孵育使抗體與受體結(jié)合。再加入蛋白A/G瓊脂糖珠，通過(guò)抗體與珠子結(jié)合沉淀受體蛋白復(fù)合物。最后通過(guò)Western blot檢測(cè)沉淀物中是否存在配體蛋白，若檢測(cè)到配體，則說(shuō)明二者在細(xì)胞中存在結(jié)合。

（5）表面等離子共振檢測(cè)配體-受體結(jié)合

強(qiáng)度將受體固定在SPR芯片表面，配體在流動(dòng)相中通過(guò)芯片表面。SPR技術(shù)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)配體與受體結(jié)合過(guò)程中的折射率變化，從而獲得結(jié)合親和力（KD）、結(jié)合速率常數(shù)（ka）和解離速率常數(shù)（kd）等動(dòng)力學(xué)參數(shù)，用于定量分析二者的結(jié)合強(qiáng)度。

（6）分析配體與受體結(jié)合后受體構(gòu)象改變

通過(guò)圓二色光譜（CD）或核磁共振（NMR）等技術(shù)，檢測(cè)受體在結(jié)合配體前后的構(gòu)象變化。CD可分析二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，NMR可提供更詳細(xì)的三維結(jié)構(gòu)信息。此外，也可利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)，通過(guò)熒光標(biāo)記的探針檢測(cè)受體內(nèi)部距離變化，間接反映構(gòu)象改變。

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主營(yíng)項(xiàng)目

1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

3. 分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

4. 蛋白實(shí)驗(yàn)

WB、Co-IP、酵母雙雜

5. 病理實(shí)驗(yàn)

HE染色、免疫組學(xué)、電鏡

6. 生理生化實(shí)驗(yàn)

肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。

7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)

基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析

8. 整體課題實(shí)驗(yàn)

方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書(shū)寫(xiě)作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿

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