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對于低含量的目的細胞，知道其大致比例，有助于確定流式分析、分選實驗流程中的許多關(guān)鍵要素，如：

①需要染色的樣本總量

②上流式時需要采集的細胞總數(shù)

③配色時染料的選擇

④分選時純度、得率、活性和時長的權(quán)衡

以下整理了人外周血、小鼠、大鼠各細胞亞群比例。

這些數(shù)值僅供參考（所有顯示的百分比是每個樣本中各細胞亞群占白細胞總數(shù)的百分比）?？赡軙驑悠分苽?、個體差異和所用動物的品系而異。

表1-人外周血各細胞群比例

表2-小鼠各細胞群比例

表3-大鼠各細胞群比例

補充內(nèi)容

關(guān)于需要獲取的事件數(shù)量，建議使用泊松統(tǒng)計，它定義了給定數(shù)量的事件將在固定的時間/空間間隔內(nèi)發(fā)生的概率，假設(shè)這些事件將以已知的平均速率發(fā)生，與從先前事件經(jīng)過的時間無關(guān)。

對于流式的稀有細胞檢測：N為總事件數(shù)，R為目標(biāo)細胞如陽性細胞數(shù)，P為目標(biāo)細胞比例，則為P = R / N，0≤P≤1。方差定義為：Var（R）= NP（1- P）。標(biāo)準差SD是方差的平方根，CV是等于1/SD即1 /Var的平方根*100%。應(yīng)用舉例，如檢測PBMC中的B細胞，健康個體中，CD19+B細胞比例為10％左右，因此：P = 0.1，N=5000時，計算得CV=4.71％，一般建議CV保持在5％以下，因此獲得5 000個事件也已足夠。若獲取10000個總事件，則CV=3.33％。保持達到一定的CV值，目標(biāo)細胞比例越低，需要獲取的總事件數(shù)越多。

圖1. 0.01％的稀有細胞群體的事件數(shù)量示例

下圖顯示了特定細胞稀有度比例對應(yīng)的變異系數(shù)（CV）值。CV與陽性事件的數(shù)量有關(guān)，并定義為標(biāo)準偏差 /平均值。

圖2. 特定細胞稀有度比例對應(yīng)的變異系數(shù)（CV）值

通常，更低的CV代表更好的實驗精確度和可重復(fù)性。使用此表，如果可以接受較寬的CV，則細胞比例為0.1％的10,000個事件就足夠了。但是，CV為10％時需要100次陽性事件，現(xiàn)在您可以看到10,000個事件數(shù)只有當(dāng)目標(biāo)細胞比例在1％以上的范圍內(nèi)CV值才能達到比較好的狀態(tài)（<5%）。對于非常稀有的細胞群體（萬分之一乃至十萬分之一），要達到10％的CV就需要收集100萬甚至1000萬個事件。若以每秒10,000個事件的速度進行收集，收集1000萬個事件將花費1000秒即16分鐘。

圖3.假設(shè)下游應(yīng)用需要100,000個細胞，則此圖表可以幫助您基于液滴頻率和細胞群比例來確定分選所需的起始細胞數(shù)量及所要花費的時間。

細胞頻率也是選擇熒光基團時的一個因素。對于低密度抗原，建議選擇明亮的熒光基團，但對于稀有細胞，也建議選擇明亮的熒光團，因為陰性群體中的背景染色可能會掩蓋其熒光。最后，在進行細胞分選實驗時，細胞群的頻率可能會影響分選。將需要有足夠的起始材料來為下一次實驗分選足夠數(shù)量的細胞。此外，細胞頻率也會影響收集足夠細胞所需的時間；如果對細胞進行分選所需的時間過長，則可能需要降低純度。

圖4.人血細胞染色。用CD3-PE-A750、CD4-PE、CD8-PE-A647、CD127-A647和CD25-FITC染色10萬個細胞，鑒定CD4陽性的T調(diào)節(jié)細胞。門控策略顯示，即使收集了100,000個事件，但在應(yīng)用多個門控后，最終的群體僅包含992個細胞。當(dāng)你增加門的復(fù)雜性時，收集足夠的細胞變得更加重要。

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