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相比于傳統(tǒng)的組織活檢，液體活檢具有無創(chuàng)性、敏感性、動態(tài)性等特質(zhì)，其出現(xiàn)標志著人類在攻克腫瘤癌癥的道路上又前進了一大步。因此，在介紹具體的腫瘤基因及分子檢測技術之前，先在此簡述液體活檢的基本情況。

液體活檢

■ 液體活檢是什么？

液體活檢是指，在體液樣本中提取分子標志物進行檢測分析，為患者的疾病診療提供決策信息。實際上，從腫瘤取樣角度、相對組織活檢而言，液體活檢是一類技術術語，且正在不斷演化及發(fā)展，并無確切定義。

■ 發(fā)展歷程

■ 范疇

液體活檢的采樣類型包括：血液（外周血）、唾液、尿液、腦脊液、胸腔積液等；

液體活檢分析的分子標志物包括：ctDNA、CTC、外泌體（外囊泡的一種）、腫瘤培養(yǎng)的血小板等。根據(jù)美國病理協(xié)會官網(wǎng)，液體活檢目前的重點是 ctDNA，其他包括 RNA、CTC、細胞外囊泡（EV）和腫瘤培養(yǎng)的血小板（TEP）。

■ 應用

液體活檢主要基于腫瘤釋放的細胞及核酸（DNA 和 RNA）來評估治療反應（預后監(jiān)測、殘留疾病檢測）、預測腫瘤復發(fā)風險、追蹤與耐藥性相關的突變、可靶向的驅(qū)動突變研究和臨床試驗注冊等，可以應用于應用于腫瘤分子分型、腫瘤演變及預后監(jiān)測等場景。

■ 優(yōu)勢

在臨床應用中，組織活檢通常是腫瘤診斷和治療的金標準，但存在兩方面弊端：一是侵入性意味著樣本有時無法取得，需要考慮腫瘤的位置和患者的狀態(tài)；二是組織樣本的含量低等無法滿足 NGS 等檢測的要求。

相對組織活檢，液體活檢的整體優(yōu)勢主要在于獲得侵入性要小得多，允許頻繁、連續(xù)的采樣，從而持續(xù)追蹤腫瘤發(fā)展及預后反應；另外可以在無法進行組織活檢下進行液體活檢。

■ 前景

據(jù)美國病理協(xié)會，短期內(nèi)液體活檢可能更有助于確認臨床或放射學上已明顯病變患者的惡性腫瘤；此外，其是組織活檢不可執(zhí)行情況下的可選方案。

基于已獲批產(chǎn)品，液體活檢也大大加速了新藥研發(fā)的靶點發(fā)現(xiàn)、臨床試驗入組以及伴隨診斷的發(fā)展，在預后檢測、復發(fā)評估等方面有著巨大的前景，核心挑戰(zhàn)是提高靈敏度。該領域的下一個挑戰(zhàn)和機會是將液體活檢納入常規(guī)癌癥篩查計劃，以促進癌癥早期診斷。

液體活檢包括多種技術，以下將介紹其中最具代表性的幾種。

熒光定量PCR（qPCR）及數(shù)字PCR（dPCR）

■ 定義及意義

PCR（Polymerase Chain Reactio，聚合酶鏈式反應）是在體外模擬 DNA 復制的過程，快速擴增特定基因或 DNA 序列，又稱為基因的體外擴增法。PCR 是生物芯片、測序等分子檢測技術中的基礎技術，也是一項獨立的檢測技術，對醫(yī)學診斷等領域是革新式推動。

■ 原理及步驟

完成 PCR 過程的基本要素包括：

● DNA 模板：包含目標序列的樣本 DNA

● DNA 聚合酶：合成與目標序列互補的新 DNA 鏈的酶，如TaqDNA 聚合酶

● 核苷酸：dNTP（A/T/C/G） 或脫氧核苷酸三磷酸，是構建新 DNA 鏈的元素

● 逆轉錄酶：在逆轉錄 PCR中需用逆轉錄酶將樣品 RNA 轉化為 cDNA

■ 類型

■ 實際應用

此類技術的實際應用場景極多，例如，對于類似于慢性骨髓性白血病等血液瘤，qPCR 技術可以通過檢測原癌基因易位導致的 BCR/ABL 融合基因的表達，來確定微量殘余腫瘤細胞的數(shù)量，進行治療效果評估和復發(fā)預測。

通過使用帶有突變特異性探針的 dPCR，可以在 cfDNA 中的某些突變開始出現(xiàn)在體液中時就檢測到它們。此外，dPCR 的高精度和靈敏度可用于監(jiān)測癌癥進展和早期檢測復發(fā)。

dPCR 除了可以檢測點突變，還可用于檢測 CNV。此外，研究顯示， dPCR 檢測 HPV 中 mRNA，對于組織學上無腫瘤的淋巴結中的隱匿性腫瘤細胞進行臨床評估有較大的應用潛力。

下一代測序（NGS）

■ 定義

下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS）也被稱為大規(guī)模平行測序（MPS）或高通量測序（HTS），是一種大規(guī)模、并行、高通量測序技術，以可擴展性、快速和可及性等特點，來確定基因組或部分核酸（DNA/RNA）序列的排列順序，進而分析對應調(diào)控、編碼蛋白質(zhì)等生物體特征。 

■ 類型

從分類上，NGS 包括短讀長測序及長讀長測序，短讀長測序在準確率及成本上相對成熟，廣泛應用于基礎研究及臨床等應用，但因為讀長短對于大片段結構變異及復雜基因組組裝等方面有局限；

長讀長測序目前主要應用于基礎研究，臨床應用仍在探索中，準確率及成本仍需優(yōu)化，但很好彌補了 NGS 在長片段檢測方面的局限?；蚧壅J為，在 5-10 年內(nèi)，短讀長和長讀長將在市場上互補共存。未來隨著技術迭代，極可能會出現(xiàn)集成 Sanger 測序、短讀長和長讀長優(yōu)勢的技術及工具出現(xiàn)。

■ 優(yōu)勢

NGS 在納米級空間內(nèi)進行 PCR 反應來擴增 DNA（ONT 等不需用到 PCR），基于大規(guī)模平行的反應產(chǎn)生巨大數(shù)據(jù)量。單位反應產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量逐年提高，成本超摩爾定律下降，目前全基因組測序（30x）成本低于 500 美元。極大推動了人口級大規(guī)?；驕y序基礎研究，對于將基因技術應用到臨床輔助診斷及伴隨診斷、新藥研發(fā)、病原溯源等作出了重要貢獻。

此外，隨著 PacBio 的 SMRT 技術優(yōu)化，復雜物種以及微生物的 de novo 組裝得以突破，推動生物多樣性研究；ONT 的 Nanopore 測序技術不依賴 PCR，最長讀長超過 4 Mb，結構變異檢測日趨成熟；其便攜式設備也讓測序從實驗室到野外，從地球到太空展開更廣闊的應用場景。

■ 局限

盡管優(yōu)勢很大，NGS 仍存在不少局限性，例如：

● 在癌癥液體活檢仍需提高靈敏度，特別是低濃度樣本和低頻突變；

● 成本和周期仍需優(yōu)化；

● 知識庫的匱乏使得測序后序列難以解讀，對應采取的臨床基因 Panel 產(chǎn)品設計仍不夠靈活和可擴展。

■ 實際應用

NGS 帶來大量物種及大規(guī)模樣本的基因組解析，進而與 IT 技術（生物信息、生物計算、機器學習）等結合，革新對癌癥發(fā)展和進展的基礎理解、臨床應用以及治療。目前，NGS已廣泛應用于醫(yī)學、公共衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、法醫(yī)、生物多樣性等方面的基礎研究、輔助決策及分析。

免疫組化（IHC）

■ 定義及原理

免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）簡稱免疫組化，通過標記的特異性抗體在組織細胞原位結合目標抗原，通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，可視化相應抗原在細胞內(nèi)及其適當?shù)慕M織學背景的高分辨率分布和定位。

■ 步驟

通過切片機制作病理切片，與抗體一起培養(yǎng)?？贵w結合位點與標記物（如熒光染料、酶、放射性元素或膠體金）相連，在顯微鏡下可視化。IHC 反應可以通過放射自顯影來觀察，核心是通過對細胞或組織造成最少的損傷來對大部分 IHC 進行染色，并通過使用最少的抗體，在腫瘤分型和腫瘤標志物上找到一條路。

■ 優(yōu)勢與實際應用

由于 IHC 涉及特定的抗原 - 抗體反應，且能夠?qū)⒖乖拇嬖谂c其在組織或細胞中的位置相關聯(lián)，因此它比傳統(tǒng)蛋白質(zhì)檢測方法具有明顯優(yōu)勢。目前IHC是在臨床上應用最為廣泛的病理診斷技術，廣泛應用于許多醫(yī)學研究實驗室和臨床診斷，特別是細胞功能研究和分子病理檢測。免疫組化檢測可以診斷來源不明、原發(fā)灶和未知原發(fā)腫瘤轉移的腫瘤，還可以預測乳腺癌和前列腺癌的治療反應，并進行腫瘤的病理學分型，在腫瘤基礎研究和臨床應用上起到重要作用。

質(zhì)譜分析（MS）

■ 定義及原理

質(zhì)譜，即是使樣本中各組分電離，生成不同荷質(zhì)比的離子，經(jīng)電場作用形成離子束進入質(zhì)量分析器，不同質(zhì)荷比的離子聚焦在不同的點上，得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量進而進行組分的定性分析 ; 譜峰強度與化合物含量有關，據(jù)此進行定量分析。

■ 類型

質(zhì)譜分為多種類型，包括氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）、液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS）、串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS）、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）等。

■ 優(yōu)勢及實際應用

盡管目前常用技術可以高精度（即靈敏度和特異性）測量單個蛋白質(zhì)，但由于與包括自身抗體在內(nèi)的干擾物質(zhì)（例如甲狀腺球蛋白免疫測定）的交叉反應，某些蛋白質(zhì)檢測的特異性較低，通過 LC-MS/MS 進行免疫捕獲分析可以消除干擾?；谝合嗌V和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS）對蛋白質(zhì)組進行高通量高深度研究，可獲得蛋白質(zhì)表達譜、蛋白質(zhì)翻譯后修飾、定量差異蛋白表達譜及蛋白質(zhì)相互作用信息，應用于蛋白標志物發(fā)現(xiàn)、功能蛋白和多肽的挖掘、信號通路和分子機理機制研究等。

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