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2013年，單細胞測序技術(shù)被Nature Methods雜志評選為年度技術(shù)。2019年，單細胞多組學技術(shù)再次被 Nature Methods雜志評選為年度技術(shù)。進一步說明單細胞測序未來在基礎科研乃至醫(yī)學、農(nóng)學等各個應用研究領域具有無限的潛力，將是未來科學發(fā)展的重要方向。我們一起來回顧一下單細胞測序技術(shù)發(fā)展史。

01

第一代測序技術(shù)

●時間：1970

●方法：基于DNA序列的測定方法，如引物延伸測序。

●特點：測序精度接近100%，但成本高、通量低。

●代表技術(shù)：Sanger測序法。

02

第二代測序技術(shù)

●時間：2000

●方法：高通量測序，可一次性測定數(shù)十萬至數(shù)百萬個DNA分子。

●特點：降低了測序成本，提高了通量，但仍然依賴于電泳分離技術(shù)。

●代表技術(shù)：

 Illumina平臺：如Hiseq和Novaseq。

 Solexa平臺：如Solexa Sequencing Platform。

03

第三代測序技術(shù)

●時間：2010

●方法：單細胞測序技術(shù)，包括邊合成邊測序（SBS）和納米孔測序技術(shù)。

●特點：解決了讀長短的問題，能夠直接對RNA和核酸修飾進行檢測。

●代表技術(shù)：

PacBio平臺：如SMRT技術(shù)。

Nanopore平臺：如Nanopore Technologies的MinION。

PART 01

plate-based SMART-seq

先用使用流式細胞儀或顯微操作進行細胞分選，裂解細胞，用SMART技術(shù)建立庫（使用Oligo(dT) primer對帶有polyA尾的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，所使用的MMLV酶在5'末端加C后，會繼續(xù)反過來合成DNA的另一條鏈（模板置換），由此形成雙鏈cDNA；在兩端加上PCR引物后，進行PCR擴增。

PART 02

DNA建庫方法

用酶將cNDA打碎成小片段，添加接頭用于后續(xù)測序，PCR擴增，完成建庫。

PART 03

Dropseq

DropSeq基于液滴微流控技術(shù)，首先，將細胞懸浮液與帶有分子條形碼的微珠懸浮液泵至微流控芯片，匯聚并形成層流，之后再與油相匯聚，形成單分散的微滴，將每個細胞與一個微珠一同包裹于同一微滴中，隨后完成RNA雜交并裂解微滴，釋放mRNA雜交物，完成逆轉(zhuǎn)錄，最后，以PCR方式完成核酸擴增，并進行測序分析。但該方法有個缺點，不能保證每個液滴中都有且僅有一個單細胞和一個磁珠。

PART 04

10X Genomics

這項技術(shù)整合了之前的技術(shù)，并做了改進。通過10×genomics儀器將單個細胞與單個凝膠微珠通過油相混在一起，形成油包水的小微滴，接下來把細胞膜破掉，讓細胞當中的mRNA游離出來。游離出來的mRNA與小液滴中的水相混合，和逆轉(zhuǎn)錄酶、結(jié)合在凝膠微珠上的核酸引物、以及dNTP底物相接觸，進行逆轉(zhuǎn)錄反應。mRNA與凝膠微珠上帶barcode的DNA分子相結(jié)合，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA來。barcode的作用是方便后續(xù)測序時辨認樣本來源。

PART 05

 微 孔 法 

BD Rhapsody?平臺采用微孔捕獲技術(shù)，其擴增和測序部分與10X Genomics一樣，主要區(qū)別在于主要在于捕獲單細胞。其捕獲應用到蜂巢板，將細胞懸液平鋪在只能容納一個細胞的蜂窩里，蜂窩里有磁珠。隨后，Beads 同樣由注入孔注入，即可在單個反應孔中捕獲其中的細胞。其Beads上的序列結(jié)構(gòu)也與10X Genomics 相似。

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END

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