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小編整理了 5 個 WB 實驗細節(jié)技巧，帶你從細節(jié)手法出發(fā)，優(yōu)化 WB 實驗結(jié)果。5個 WB 細節(jié)，帶你靠自己的雙手，拿到漂亮圖！

樣本切記煮沸勿偷懶

煮沸的首要目的是使蛋白質(zhì)完全變性，即破壞蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu)，使其展開成線性形式。

這樣，蛋白質(zhì)分子在電泳過程中的遷移速率將主要取決于它們的分子量，而不是它們的構(gòu)型差異。

將樣本與加載緩沖液按 1:1 比例混合將混合后的樣本在沸水浴中煮沸 5 分鐘，這個步驟可以確保蛋白質(zhì)的變性。

煮沸過程中，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成更加均勻，有助于蛋白質(zhì)在凝膠中的一致性遷移。

煮沸后立即將樣品置于冰上冷卻，這一步是為了終止變性過程，防止蛋白質(zhì)在高溫下過度降解或重新聚集。

加載緩沖液的成分：0.5M Tris-HCl pH 6.8

作用：提供一個穩(wěn)定的 pH 環(huán)境，有助于蛋白質(zhì)在電泳過程中保持穩(wěn)定。

加載緩沖液的成分：2% SDS

作用：SDS 與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成復(fù)合物，使其帶負電荷。

加載緩沖液的成分：10% 甘油

作用：增加樣品的黏度，有助于樣品在凝膠孔中的均勻分布。

加載緩沖液的成分：0.01% 溴酚藍

作用：作為追蹤染料，幫助觀察樣品在電泳過程中的遷移情況。

加載緩沖液的成分：5% β 巰基乙醇

作用：有助于破壞蛋白質(zhì)中的二硫鍵，進一步促進蛋白質(zhì)的變性。

通過這些步驟，可以確保蛋白質(zhì)在凝膠電泳中的表現(xiàn)更加一致和準(zhǔn)確，從而得到可靠的實驗結(jié)果。

電泳條件需謹(jǐn)慎遵循

電泳條件對于 Western Blot 實驗的成功至關(guān)重要，因為它們直接影響蛋白質(zhì)的分離效率和結(jié)果的清晰度，但是很多同學(xué)會「湊合用膠」，沒有完全根據(jù)目標(biāo)蛋白大小選擇合適的凝膠濃度和電泳條件。

不過也要注意，電壓推薦是針對恒定電壓條件下的電泳，實際使用時應(yīng)根據(jù)凝膠的尺寸、電泳槽的類型以及具體的實驗條件進行調(diào)整。

另外對于較小分子量的蛋白質(zhì)，可能需要使用較高的電壓以加快遷移速度，但要注意避免過熱和條帶壓縮。

對于較大的蛋白質(zhì)，使用較低的電壓有助于減少條帶壓縮，但可能需要更長的電泳時間來確保充分分離。

最后，實驗中可能需要根據(jù)具體的實驗結(jié)果調(diào)整電壓和凝膠濃度，以獲得最佳的分離效果。

ECL 底物添加有技巧

提供足夠的底物以產(chǎn)生穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光信號。不過一定要嚴(yán)格按照制造商提供的說明書來配制 ECL 底物。很多同學(xué)在這步容易使用已經(jīng)配置、使用過的 ECL 底物，可能會影響研究結(jié)果。操作步驟：

配制 ECL 底物

目的和注意事項：按照說明書比例混合 A 和 B 組分，確保新鮮配制

膜的預(yù)處理

目的和注意事項：確保膜完全濕潤，無氣泡，使用適當(dāng)?shù)木彌_液

浸泡膜于 ECL 底物中

目的和注意事項：1 分鐘，確保膜表面均勻覆蓋，避免過長浸泡導(dǎo)致底物干燥或過度滲透

去除膜表面多余底物

目的和注意事項：輕輕搖動或用濾紙吸去，減少背景噪音

封閉袋內(nèi)成像

目的和注意事項：根據(jù)信號強度調(diào)整曝光時間，進行成像初始曝光時間可以從短曝光開始（例如 5 秒或 30 秒），根據(jù)成像結(jié)果調(diào)整，一般會選擇過曝前的 3-5 張結(jié)果來進行分析、使用。

使用手套做實驗！千萬別觸碰

使用一次性手套在實驗室中是基本的無菌操作要求，尤其在細胞間，但是出了細胞間，很多同學(xué)就開始用「回收手套」，甚至不戴手套拿個管子瓶子，這也會對 WB 實驗帶來交叉污染。

可能影響：交叉污染

具體說明：皮膚油脂、死皮細胞或微生物可能污染樣本，導(dǎo)致實驗結(jié)果不可靠。預(yù)防措施：在處理樣本前后更換一次性手套，避免接觸不同樣本時的交叉污染。

可能影響：樣品降解

具體說明：皮膚上的酶可能降解樣本中的蛋白質(zhì)，影響目標(biāo)蛋白的檢測。預(yù)防措施：使用手套防止皮膚直接接觸樣本。

可能影響：膜損壞

具體說明：直接接觸可能導(dǎo)致 PVDF 或硝酸纖維素膜的物理損傷。預(yù)防措施：佩戴手套以減少直接接觸，使用鑷子或?qū)Ｓ霉ぞ卟僮鳌?/p>

可能影響：試劑污染

具體說明：手套可以防止皮膚油脂污染試劑，保持試劑的純凈度。預(yù)防措施：始終佩戴手套處理試劑。

在實驗過程中，除了佩戴手套外，還應(yīng)根據(jù)實驗內(nèi)容采取其他個人防護措施，如實驗室大衣、護目鏡等。

通過遵循這些操作指南和注意事項，可以最大限度地減少實驗過程中的交叉污染，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

注意儀器的日常維護

最后的最后，別忘記提醒實驗室研究員定期校準(zhǔn)電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀，檢查電壓和電流的穩(wěn)定性。

清潔和維護設(shè)備，確保無漏電或短路；校準(zhǔn)應(yīng)記錄電壓、電流和時間，確保設(shè)備在規(guī)定范圍內(nèi)運行。

日常維護：每次使用儀器后進行，主要是清潔工作，確保儀器表面和操作區(qū)域的清潔。

月度檢查：每月進行，重點在于檢查儀器的所有控制元件和指示系統(tǒng)是否正常工作。

季度檢查：每 3 個月進行一次，電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀分別進行性能校準(zhǔn)和溫度系統(tǒng)檢查，以確保設(shè)備性能穩(wěn)定。

半年檢查：每 6 個月進行深度清潔和安全檢查，包括清潔難以觸及的部分和檢查電線、連接器等，以確保設(shè)備安全。

通過精確控制這些關(guān)鍵細節(jié)，相信大家也可以顯著提高 WB 實驗的成功率和結(jié)果的可靠性。拒絕科研造假，用自己的雙手做出漂亮條帶！

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