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Western blotting（免疫印跡分析）是一種常用的蛋白質(zhì)檢測技術，用于檢測樣品中特定蛋白質(zhì)的存在和定量。WB作為一個最為基礎的生命科學檢測方法之一，經(jīng)過長時間摸索與分析，目前已經(jīng)有了一系列適配性較高的通用WB實驗檢測方案和流程。但是蛋白質(zhì)作為一個特異性較強的檢測指標，總會有一些并不適用于常規(guī)化方法的個體，需要我們對實驗步驟進行優(yōu)化或者修改，才能保證得出一個較為理想的結果。

小分子蛋白

小分子蛋白主要指WB檢測中小于20kDa的蛋白質(zhì)，由于分子量小易降解，且?guī)щ姾闪恳蚕鄬^少，所以導致其吸附能力比較弱。常用的蛋白WB步驟通常會導致檢測結果不穩(wěn)定，時有時無，甚至出現(xiàn)轉膜失敗，蛋白彌散等完全看不到目標條帶的情況。針對小分子蛋白的WB檢測，應該對實驗步驟進行優(yōu)化，以提高結果的準確性。

上樣

通常Western Blot每孔上樣量為30-50 μg，當?shù)鞍追肿恿窟^小時，在跑電泳時容易出現(xiàn)較為嚴重的彌散情況，上樣量建議選擇50-100 μg。

電泳

配置SDS-PAGE膠時，在高濃度的12%-15%的分離膠中進行電泳，同時加大濃縮膠的比例，使得濃縮膠與分離膠的比例約為4：6，甚至可以5：5，這樣可以讓小分子蛋白在濃縮膠中充分的濃縮，在后續(xù)的分離中減少彌散程度。

電泳時，以80v電壓進行壓縮，時間約為40min，電泳至兩種膠的界面。然后將電壓調(diào)整到100v，在12%-15%的分離膠中進行電泳，跑到分離膠一半的位置，一般10kDa的marker能夠分開就可以了，目的是避免長時間的電泳使得小分子蛋白彌散。

轉膜封閉

小分子蛋白由于其分子量小，易降解，吸附能力弱，在轉膜時一般使用0.22μm的PVDF膜，在轉膜的時候，不要在轉膜液中加入SDS，防止小分子蛋白與PVDF膜無法結合，可以將甲醇的濃度提升至30%，增強蛋白與膜的結合性。

小分子蛋白實例詳解

IL-8 Rabbit mAb

IL-8蛋白（interleukin-8 protein）是一種促炎性細胞因子，大小約為11kDa，通常由許多細胞產(chǎn)生，包括巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞等。IL-8在免疫應答中發(fā)揮關鍵作用，包括誘導中性粒細胞等免疫細胞向炎癥部位遷移，并刺激這些細胞的激活。

大分子蛋白

大分子蛋白一般指分子量大于200kDa的蛋白質(zhì)，由于其分子量大，遷移速度慢，轉膜困難等特征，在WB中有時可能難以獲得清晰的條帶，因為這些蛋白質(zhì)的遷移和轉移可能會受到影響。

上樣

在樣本制備時適當增加變性時間和溫度，確保充分變性和還原，以便大分子蛋白完全展開。同時避免使用過多的樣品，以免蛋白聚集導致條帶模糊。

電泳

大分子蛋白在電泳時，使用6%-8%的分離膠，200kDa以上建議6%進行分離，轉膜時膠比較軟，注意輕拿輕放，避免凝膠破碎，影響實驗結果。

由于其較慢的遷移速度，建議使用低電壓進行電泳。例如，可以選擇在80-100V下運行整個凝膠。這有助于防止蛋白過快遷移并避免凝膠過熱，同時增加電泳時間，使大蛋白有足夠的時間遷移。

轉膜封閉

大蛋白的轉膜通常比較困難，一般使用濕式轉移并延長轉移時間，保證蛋白活性和充分轉膜。常用的轉膜條件為80v，根據(jù)蛋白的大小，時間通常設定為3h-5h，甚至更久的轉膜時間都是可取的。對于200kDa以上的蛋白，建議20v在4℃轉膜過夜，可以得到比較好的效果。

大分子蛋白實例詳解

p300 Rabbit pAb

p300蛋白是一種重要的轉錄調(diào)節(jié)蛋白，大小為300kDa左右，被稱為組蛋白乙型丙酮乙酸轉移酶，是胞漿酶的一種。p300在細胞核中發(fā)揮重要作用，參與許多細胞核過程的調(diào)節(jié)，包括基因轉錄、DNA復制、DNA修復以及細胞增殖和分化等。

跨膜蛋白

膜蛋白在高溫煮沸時，容易發(fā)生聚集現(xiàn)象，形成二聚體或多聚體，聚集后分子量變大，造成后續(xù)無法檢測到條帶或檢出的條帶位置不對。故膜蛋白樣品不宜煮沸，建議根據(jù)蛋白具體屬性在50-70 ℃ 左右進行熱變性。還有一些對熱特別敏感的蛋白，對熱變性的溫度有特殊要求，例如植物樣品。植物中對熱敏感的蛋白比較多，有的蛋白熱變性溫度需要與感受態(tài)轉化溫度（42 ℃）一樣，過高則檢測不到?？偠灾绻麡悠肥悄さ鞍?，需要根據(jù)樣品本身情況，謹慎調(diào)整熱變性的溫度，以提高檢測效率。對于跨膜蛋白，常用可參考的變性溫度是50-70℃ 15min或者 37℃ 30min。

跨膜蛋白實例詳解

SLC16A3 Rabbit pAb

SLC16A3蛋白是一種單羧酸轉運體4（MCT4）蛋白，大小為49kDa左右，它參與乳酸和其他小分子單羧酸物質(zhì)的跨膜運輸。這種蛋白在許多生理過程中發(fā)揮作用，包括能量代謝和pH調(diào)節(jié)。

綜上所述，成功的實驗往往需要前期扎實的背景調(diào)研和細致的實驗操作，預實驗的重要性在于研究人員可以調(diào)整蛋白質(zhì)抽提、電泳、轉膜和免疫印跡等步驟，以優(yōu)化實驗條件并確定最適合的抗體濃度和工作條件，以便成功檢測目標蛋白質(zhì)。這有助于確保后續(xù)的實驗數(shù)據(jù)得到正確解釋，從而對研究結果的準確性和可靠性產(chǎn)生重要影響。

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